PCR實驗需要純化水嗎

1. 娃哈哈純凈水實驗pcr行嗎

不行裡面還有些雜質的，雖然說是純凈水，但是在中國這些東西有多少能信？

2. 基因測序，pcr對純水有什麼要求

PCR產物直接測序技術現已成為分子生物學和基因組學研究中的一個重要技術,廣泛用於基因突變檢測、遺傳性疾病診斷、單核苷酸多態性研究、基因組重疊序列群等.與傳統克隆測序技術相比較,直接對PCR擴增的DNA進行測序,省去了耗時的克隆步驟,避免了傳統的細菌培養,模板提取等重復性操作,可以從少量的原始樣品中得到正確的DNA序列信息.PCR產物直接測序技術具有快速、簡便、穩定經濟的優點. 試驗試劑 PCR擴增的雙鏈DNA模板長約20個核苷酸的DNA引物 DNA聚合酶測序膠 0.1mol/L DDT α-32P-dATP dNTP/ddNTP混合物(80μmol/L/8μmol/L) dNTP(dCTP、dGTP 、dTTP 各0.75μmol/L) 測序反應緩沖液：40mmol/L Tris-HCl(pH7.5),20mmol/L MgCl2,50mmol/L NaCl 終止緩沖液：95% 甲醯胺,20mmol/L EDTA,0.05% 溴酚藍,0.05% 二甲苯腈試驗步驟： 1、 4個微量離心管中各加入dNTP/ddNTP混合物2.5μl,混合物37OC溫浴5min,備用. 2、 在一個空的微量離心管中加入1pmol的PCR擴增雙鏈DNA,10pmol測序引物,2μl 5×測序緩沖液,加雙蒸水至總體積10μl,96OC加熱8min,冰浴泠卻1min,4OC 10000g離心10s. 3、 加入2μl預冷的標記混合物(dCTP、dGTP 、dTTP 各0.75μmol/L),α-32P-dATP 5μCi,1μl 0.1mol/L DDT,測序酶2U,加水至15μl,混勻後置冰上2min,標記新合成的DNA鏈. 4、 在第1步驟的4個管中各加入3.5μl標記反應混合物,37OC溫浴5min.每管各加入4μl終止液. 5、 樣品在80OC的水浴中熱變性5min,每一泳道加2μl 加到測序膠上,電泳分離這些片段. 注意事項： 1.?PCR產物要有一定的長度(>200bp),因為測序結果兩端20-30bp的電泳峰圖的准確性較低. 2.?純化PCR產物可通過離子交換層析使擴增的DNA段與反應剩餘的dNTP及引物分離；也可通過瓊脂糖凝膠電泳,將PCR產物與非特異性擴增產物和引物分離開來；如果擴增的特異性較高時,可直接通過酚：氯仿抽提,乙醇沉澱的方法來純化. 3.?測序引物設計原則類似於PCR引物設計,可在DNA合成儀上合成20個左右的核苷酸作為引物,經過高壓液相層析或聚丙烯醯胺凝膠電泳純化後,即可用作測序引物. PCR循環測序法 PCR循環測序法是將PCR擴增和核酸序列分析技術相結合,從而形成的一種測定核苷酸序列的研究方法,也稱作線性擴增測序.該方法採用PCR儀加熱使DNA模板變性,在TaqDNA聚合酶作用下,以溫度循環模式在模板上進行多輪的雙脫氧核苷酸測序反應,線性擴增標記的DNA分子. PCR循環測序法與以往的測序方法相比,其優點在於：大大減少所需的模板量；能提高測序反應產生的信號,降低了操作的復雜性,且聚合酶的用量減少；可在小量制備的模板上進行篩選反應；高溫下進行的測序反應使DNA聚合酶催化的聚合反應能夠通過模板二級結構的區域；雙鏈閉環DNA可以直接作為反應模板應用,不用作預先鹼變性處理.由於PCR循環測序法能夠簡單、快速地檢測特定序列,因此, PCR循環測序法在核酸序列分析研究中受到廣泛的重視. 試驗試劑： DNA測序試劑盒 dNTP ddNTP 丙烯醯胺雙丙烯醯胺尿素 TEMED(N,N,N『,N』-四甲基乙二胺) 過硫酸銨 6%測序膠：6%丙烯醯胺,7mmol/L 尿素,1×TBE. 10×測序緩沖液：100mmol/L Tris-HCl(pH8.8),500mmol/L KCl,40mmol/L MgCl2,0.01%明膠,20μmol/L dATP,50μmol/L dCTP,50μmol/L dGTP,50μmol/L dTTP 終止混合液：ddATP (600μmol/L),ddCTP (600μmol/L),ddGTP (100μmol/L),ddTTP(1000μmol/L) 終止緩沖液：95%甲醯胺,20mmol/L EDTA,0.05%溴酚藍,0.05%二甲苯腈試驗步驟 1、 4個小離心管,每個小管加入3μl的終止混合液,將管子放在冰上. 2、 在DNA模板中加入引物(4pmol), 4μl 10×測序緩沖液, 10μlα-32P-dATP, 2U TaqDNA聚合酶,加雙蒸水到30μl徹底混勻,每管7μl加入上面4個小管中. 3、 反應液上加30μl的石蠟油. 4、 95OC 30S,50OC 30S,72OC 60S共30個循環,可根據具體的情況進行適當的調整循環條件及循環次數. 5、 反應結束後在油層下加入5μl的終止緩沖液並用加樣槍混勻. 6、 上樣前將樣品在大於80OC的水浴中熱變性5min,每一道加2μl加到測序膠上,電泳分離這些片段. 注意事項： 1、 制備測序模板：PCR 擴增的產物可以經過低熔點的瓊脂糖凝膠電泳純化回收後,用於序列分析；可經過柱層析純化,去除PCR 反應後剩餘的dNTP和引物後,用於序列分析.PCR 產物也可不經純化直接用於測序,但是這種測序產生的結果較差,建議測序之前應進行PCR產物的純化.各種標準的質粒制備方法所純化出的質粒均可作為測序模板使用.用標准方法制備的M13噬菌體、粘粒、λDNA都適合用作測序模板用.但要注意的是反應體系中不應有與引物互補的非目的基因序列,否則將會導致測序實驗的失敗. 2、 測序引物：測序引物是指合成的與測序模板鏈特異性互補的寡核苷酸序列.可用α-32P-dATP和T4多聚核苷酸激酶對引物的5『端進行標記,反應體系中引物、激酶和α-32P-dATP要保持在最佳的比例,以得到高比活性的標記引物；也可用α-32P-dATP標記新合成的DNA鏈.引物的濃度不宜高,否則容易形成引物二聚體,或產生非特異性的擴增引物. 3、 酶：各種缺乏3『—5『端外切活性的耐熱DNA聚合酶都可以用於循環測序,其中TaqDNA聚合酶在DNA測序中最為常用.雖然應用PCR循環測序法能夠簡單、快速的進行基因序列的測定,但仍未能適應大規模DNA序列測定的需要,而PCR循環測序法、熒游標記和自動測序儀的聯合使用成為大規模基因組測序的主要技術.該技術是採用熒游標記引物或雙脫氧核苷三磷酸,反應產物經聚丙烯醯胺凝膠電泳後,經特定的DNA序列分析儀和分析系統處理待測的DNA序列.它的應用減輕了DNA序列測定的工作量,提高了測序的效率.

3. 檢驗科微生物和pcr實驗室需要做凈化么

1、操作沙門氏菌活體（細胞水平！！），原則上應該在生物安全櫃中進行；如果沒有生物安全櫃，在有嚴格的個人物理隔離（如工作服、手套、蜜漬、口罩等），可在無菌室進行作業；
2、對於pcr法鑒定沙門氏菌，如果有條件，可在生物安全櫃中提取沙門氏菌dna（分子水平！！）。因沙門氏菌dna無致病性，PCR擴增、電泳等步驟不必在生物安全櫃中進行。

4. pcr試劑配製可以用車間純化水嗎

PCR產物直接測序技術復現已成為制分子生物學和基因組學研究中的一個重要技術,廣泛用於基因突變檢測、遺傳性疾病診斷、單核苷酸多態性研究、基因組重疊序列群等.與傳統克隆測序技術相比較,直接對PCR擴增的DNA進行測序,省去了耗時的克隆步驟,避免了傳.

5. PCR實驗生理鹽水能否代替純化水

不可以
1、生理鹽水就是NaCl的水溶液 所以裡面會有Na離子和Cl離子
2、PCR過程中只需要Mg離子 其他的回所有都是多餘的
3、所以答使用水的時候也只能使用去離子水，既ddH2O，否則對PCR結果會有干擾
4、具體有什麼干擾 可能是條帶不清晰（產量少）甚至有些比較長鏈的DNA本來就不好P 會直接P不出來

6. PCR實驗過程中的注意事項

PCR產物的電泳檢測時間 一般為48h以內,有些最好於當日電泳檢測,大於48h後帶型不規則甚至消失.
PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備,②引物的質量與特異性,③酶的質量及, ④PCR循環條件.尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究.
酶切分析：
根據PCR產物中限制性內切酶的位點,用相應的酶切、電泳分離後,獲得符合理論的片段,此法既能進行產物的鑒定,又能對靶基因分型,還能進行變異性研究. 分子雜交：分子雜交是檢測PCR產物特異性的有力證據,也是檢測PCR 產物鹼基突變的有效方法. Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內部寡核苷酸)標記後做探針,與PCR產物雜交.此法既可作特異性鑒定,又可以提高檢測PCR產物的靈敏度,還可知其分子量及條帶形狀,主要用於科研. 斑點雜交： 將PCR產物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上,再用內部寡核苷酸探針雜交,觀察有無著色斑點,主要用於PCR產物特異性鑒定及變異分析. 氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份,用乙醇或異丙醇沉澱 核酸.提取的核酸即可作為模板用於PCR反應.一般臨床檢測標本,可採用快速簡便的方法溶解細胞,裂解病原體,消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離,直接用於PCR擴增.RNA模板提取一般採用異硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA.
溫度與時間的設置： 基於PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點.在標准反應中採用三溫度點法,雙鏈DNA在90～95℃變性,再迅速冷卻至40 ～60℃,引物退火並結合到靶序列上,然後快速升溫至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸.對於較短靶基因(長度為100～300bp時)可採用二溫度點法, 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般採用94℃變性,65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性).
實驗操作注意事項 盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因,樣品間的交叉污染也是原因之一.因此,不僅要在進行擴增反應是謹慎認真,在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應該注意：
1. 戴一次性手套,若不小心濺上反應液,立即更換手套；
2. 使用一次性吸頭,嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用,吸頭不要長時間暴露於空氣中,避免氣溶膠的污染；
3. 避免反應液飛濺,打開反應管時為避免此種情況,開蓋前稍離心收集液體於管底.若不小心濺到手套或桌面上,應立刻更換手套並用稀酸擦拭桌面；
4. 操作多份樣品時,制備反應混合液,先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好,然後分裝,這樣即可以減少操作,避免污染,又可以增加反應的精確度；
5. 最後加入反應模板,加入後蓋緊反應管；
6. 操作時設立陰陽性對照和空白對照,即可驗證PCR反應的可靠性,又可以協助判斷擴增系統的可信性；
7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器,由於加樣器最容易受產物氣溶膠或標本DNA的污染,最好使用可替換或高壓處理的加樣器.如沒有這種特殊的加樣器,至少PCR操作過程中加樣器應該專用,不能交叉使用,尤其是PCR產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區；
8. 重復實驗,驗證結果,慎下結論.

7. PCR實驗室有潔凈度要求嗎

我明白你在擔心PCR的高靈敏度. 但是引物是特異性的, 而且你的目的片段的濃度要大大大於環境里隨機片段的濃度. 所以環境是不要求的. 樓主還是擔心一下引物二聚體和非特異擴增吧.

8. 做配葯品，稀釋引物，PCR實驗中，對水的要求要很高么

配製一般化學試劑使用二級水即可。

配製生化試劑，包括引物稀釋、PCR所用水，以及轉膜、核酸抽提等，必須使用二次蒸餾水或一級水。

9. 細胞實驗室是否需要純水、超純水，設計時要不要把純水系統設計進去

你做細胞實驗基本是離不開純水和超純水的，不論你是做動植物實驗、細胞免疫化學、PCR實驗、蛋白質純化以及電泳/凝膠分析，都是要用到超純水的。建議你設計時最好把超純水系統也設計進去，以後你的幾個實驗室直接用設計好的超純水系統的管道取水即可。你可以聯系南京權坤。

10. 做PCR實驗需要准備哪些實驗耗材

高壓過的超純水，高壓滅菌過的藍色、白色和黃色槍頭，100ul、500ul和1ml離心管，大量的話需要排管（12連管），放置離心管用的的架子（96孔板等）。PCR最好在冰上進行，所以准備冰盒。