純化水微生物限度檢查中國葯典

1. 求助：關於15版葯典微生物限度檢驗周期的問題

《中國葯典來》2010版一部、源二部、三部附錄的微生物限度檢查法內容無差別，故此文方法，以《中國葯典》2010版二部附錄ⅪJ為例。
微生物限度檢查應在環境潔凈度10000 級下的局部潔凈度100 級的單向流空氣區域內進行。檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止再污染。單向流空氣區域、工作檯面及環境應定期按《醫葯工業潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標准進行潔凈度驗證。
供試品檢查時，如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑，應證明其有效性及對微生物無毒性。
除另有規定外，本檢查法中細菌及控制菌培養溫度為30℃～35℃；黴菌、酵母菌培養溫度為23℃～28℃。
檢驗結果以1g、1ml、10g、10ml、10c㎡ 為單位報告，特殊品種可以最小包裝單位報告。
註：《醫葯工業潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標准分為GB/T16292-2010 醫葯工業潔凈室(區)懸浮粒子的測試方法GB/T16293-2010 醫葯工業潔凈室(區)浮游菌的測試方法GB/T16294-2010 醫葯工業潔凈室(區)沉降菌的測試方法

2. 中國葯典微生物限度檢查法的微生物限度標准

非無菌葯品的微生物限度標準是基於葯品的給葯途徑及對患者健康潛在的危害而制訂的。葯品的生產、貯存、銷售過程中的檢驗，原料及輔料的檢驗，新葯標准制訂，進口葯品標准復核，考察葯品質量及仲裁等，除另有規定外，其微生物限度均以本標准為依據。 細菌數每1g不得過l000cfu。每lml不得過100cfu。
黴菌和酵母菌數每lg或lml不得過100cfu。
大腸埃希菌每1g或lml不得檢出. 3.1用於手術、燒傷及嚴重創傷的局部給葯制劑應符合無菌檢查法規定。
3.2耳、鼻及呼吸道吸入給葯制劑
細菌數每1g、lml或l0cm²，不得過100cfu。
黴菌和酵母菌數每1g、lml或l0cm²，不得過10cfu。
金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌每1g、lml或l0cm²不得檢出。
大腸埃希菌鼻及呼吸道給葯的制劑，每1g、lml或l0cm²，不得檢出。
3.3陰道、尿道給葯制劑
細菌數每1g、lml或l0cm²，不得過100cfu。
黴菌數和酵母菌數每1g、lml或l0cm²應小於10cfu。
金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌每1g、lml或l0cm²，不得檢出。
3 .4直腸給葯制劑
細菌數每1g不得過l000cfu。每lml不得過100cfu。
黴菌和酵母菌數每1g或lml不得過100cfu。
金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌每lg或lml不得檢出。
3.5其他局部給葯制劑
細菌數每1g、lml或l0cm²不得過100cfu。
黴菌和酵母菌數每1g、lml或l0cm²不得過100cfu。
金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌每1g、lml或l0cm²不得檢出。 參照相應制劑的微生物限度標准執行。
注1：本檢查法中白色念珠菌檢查所描述該菌在念珠菌顯色培養基上的菌落特徵，是指該菌在法國科瑪嘉公司提供的科瑪嘉念珠菌顯色培養基上生長的菌落特徵。給出這一信息是為了方便本方法的使用者，並不表示對該公司產品的認可．若其他等效產品具有相同的效果，那麼也可使用其他等效的產品。
以上文中方法中提到的「無菌檢查法（附錄XII A）」為《中國葯典》2010版二部附錄XII A無菌檢查法。

3. 微生物限度檢查在中國葯典2015版附錄多少

《中國葯典》2015年版微生物限度檢查法修訂後將分為三個附錄：

1、非無菌葯品微生物限度檢查：微生物計數法

2、非無菌葯品微生物限度檢查：控制菌檢查法

3、非無菌葯品微生物限度標准。

修訂後的微生物限度檢查法暫不收載於《中國葯典》2010年版第二增補本而將直接收載《中國葯典》2015年版，在正式實施前的公示期內將進一步完善以保證方法的適應性和可操作性。

非無菌葯品微生物限度標準的整合、修訂

1、葯典委員會微生物專業委員會的修訂思路

2、修訂後限度標準的總體結構

3、修訂後限度標准各項具體規定

葯典委員會微生物專業委員會的修訂思路

修訂思路

(1) 2010版中國葯典一、二、三部微生物限度本中項目的對比、整合

整合：採用一部的項目作為合並後限度標準的基礎

(2)與美、歐、日葯典比較，修訂中國葯典的微生物限度標准

1、參照歐、美、日葯典一致的表示形式，採用較清晰直觀的表格形式列出各類葯品和原敷料的微生物限度標准

2、菌數計數結果以10n表示；

3、以「需氧菌總數」取代「細菌數」，以「耐膽鹽革蘭陰性菌」取代「大腸菌群」

2、修訂後限度標準的總體結構（共9項、4個表）

1、制劑通則、品種項下要求無菌的制劑及標示無菌的制劑和原輔料應符合無菌檢查法的規定

2、用於手術、燒傷或嚴重創傷的局部給葯制劑應符合無菌檢查法的規定

3、非無菌化學葯品及生物製品制劑的微生物限度標准

4、非無菌不含葯材原粉的中葯制劑微生物限度標准

5、非無菌含葯材原粉的中葯制劑微生物限度標准

6、非無菌的葯用原料及輔料微生物限度標准

7、中葯提取物及中葯飲片的微生物限度標准

8、有兼用途徑的制劑應符合各給葯途徑的標准

9、霉變、長蟎者以不合格論

2015版微生物限度標準的特點及展望

特點：

1、很好地分析、匯總了現一、二、三部的限度標準的項目

能考慮和前向性地制訂符合我國傳統中葯特點的微生物限度標准

2、化學葯、生物製品的限度標准（菌數及控制菌）已與美、歐、日葯典的限度標准一致或更嚴格

3、新設立的中葯提取物和中葯飲片的微生物限度標准（僅規定了控制菌），菌數計數限度等待調研數據

展望：

1、結合GMP管理的步伐，進一步合理制定含葯材原粉的中葯制劑的微生物限度標准

2、在開展課題積累數據、區分用法的基數上完善中葯提取物、中葯飲片、草葯的微生物限度標准

4. 2015中國葯典對無菌檢查與微生物限度檢查的環境分別有什麼要求

兩個都是在背景10000級潔凈度下，局部100級的單層空氣氣流下進行的

5. 中國葯典微生物限度檢查法的檢驗量和供試液制備

檢驗量即一次試驗所用的供試品量（g、ml或cm²）。
除另有規定外，一般供試品的檢驗量為10g或10ml；膜劑為100cm²；貴重葯品、微量包裝葯品的檢驗量可以酌減。要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗量應增加20g或20ml（其中10g或10ml用於陽性對照試驗）。
檢驗時,應從2個以上最小包裝單位中抽取供試品，膜劑還不得少於4片。
一般應隨機抽取不少於檢驗用星（兩個以上最小包裝單位）的3倍最供試品。 根據供試品的理化特性與生物學特性，採取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時，應均勻加熱，且溫度不應超過45℃。供試液從制備至加入檢驗用培養基，不得超過1小時。
除另有規定外，常用的供試液制備方法如下。
1.液體供試品
取供試品10ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液至100ml，混勻，作為l:10的供試液。油劑可加入適量的無菌聚山梨酯80使供試品分散均勻。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。
2.固體、半固體或黏稠性供試品
取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液至100ml，用勻漿儀或其他適宜的方法，混勻，作為1:10的供試液。必要時加適量的無菌聚山梨酯80，並置水浴中適當加溫使供試品分散均勻。
3.需用特殊方法制備供試液的供試品
（1）非水溶性供試品
方法1 取供試品5g（或5ml )，加至含溶化的（溫度不超過45℃）5g司盤80、3g單硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80無菌混合物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團後，慢慢加人45 ℃的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液至100ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1 : 20的供試液。
方法2 取供試品10g，加至含20ml無菌十四烷酸異丙酯（製法見附錄XII A無菌檢查法中供試品的無菌檢查項下）和無菌玻璃珠的適宜容器中．必要時可增加十四烷酸異丙酯的用量，充分振搖，使供試品溶解。然後加入45 ℃的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液100ml，振搖5～10分鍾，萃取，靜置使油水明顯分層，取其水層作為l : 10的供試液。
（2）膜劑供試品
取供試品100cm²，剪碎，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液100ml（必要時可增加稀釋液），浸泡，振搖，作為1:10的供試液。
（3）腸溶及結腸溶制劑供試品
取供試品10g，加pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液（用於腸溶制劑）或pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液（用於結腸溶制劑）至100ml，置45 ℃水浴中，振搖，使溶解，作為1 :10的供試液。
（4）氣霧劑、噴霧劑供試品
取規定量供試品，置冰凍室冷凍約1小時，取出，迅速消毒供試品開啟部位，用無菌鋼錐在該部位鑽一小孔，放至室溫，並輕輕轉動容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌注射器吸出全部葯液，加至適量的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液（若含非水溶性成分，加適覺的無菌聚山梨酯80）中，混勻，取相當於10g或10ml的供試品，再稀釋成1:10的供試液。
（5）貼劑供試品
取規定量供試品，去掉貼劑的保護層，放置在無菌玻璃或塑料片上，粘貼面朝上。用適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布）覆蓋貼劑的粘貼面，以避免貼劑粘貼在一起。然後將其置於適宜體積並含有表面活性劑（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀釋劑中，用力振盪至少30分鍾，製成供試液。貼劑也可採用其他適宜的方法制備成供試液。
（6）具抑菌活性的供試品
當供試品有抑菌活性時，採用下列方法進行處理，以消除供試液的抑菌活性，再依法檢查。常用的方法如下。
①培養基稀釋法取規定量的供試液，至較大量的培養基中，使單位體積內的供試品含量減少，至不含抑菌作用。測定細菌、黴菌及酵母菌的菌數時，取同稀釋級的供試液2ml，每1ml供試液可等量分注多個平皿，傾注瓊脂培養基，混勻，凝固，培養，計數。每1ml供試液所注的平皿中生長的菌落數之和即為1ml的菌落數，計算每1ml供試液的平均菌落數，按平皿法計數規則報告菌數；控制菌檢查時，可加大增菌培養基的用量。
②離心沉澱法取一定量的供試液，500轉/分鍾離心3分鍾，取全部上清液混合。用於細菌檢查。
③薄膜過濾法見細菌、黴菌及酵母菌計數項下的「薄膜過濾法」。
④中和法凡含汞、砷或防腐劑等具有抑菌作用的供試品，可用適宜的中和劑或滅活劑消除其抑菌成分。中和劑或滅活劑可加在所用的稀釋液或培養基中。

6. 中國葯典微生物限度檢查法的稀釋液和培養基制備方法

稀釋液配製後，應採用驗證合格的滅菌程序滅菌。
1 .pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液
照無菌檢查法（附錄XII A）制備。
2.pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液、pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液
按緩沖液（二部附錄XV D）配製後，過濾，分裝，滅菌。
如需要，可在上述稀釋液滅菌前或滅菌後加入表面活性劑或中和劑等。
3.0.9%無菌氯化鈉溶液
取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000ml，過濾，分裝，滅菌。 培養基可按以下處方制備，也可使用按該處方生產的符合要求的脫水培養基。配製後，應採用驗證合格的滅菌程序滅菌。
1.營養瓊脂培養基、營養肉湯培養基、硫乙醇酸鹽流體培養基、改良馬丁培養基及改良馬丁瓊脂培養基
照無菌檢查法（附錄XII A）制備。
2.玫瑰紅鈉瓊脂培養基
腖 5.0g
玫瑰紅鈉 0.0133g
葡萄糖 10.0g
瓊脂 14.0g
磷酸二氫鉀 1.0g
水 1000ml
硫酸鎂 0.5g
除葡萄糖、玫瑰紅鈉外，取上述成分，混合，微溫溶解，濾過，加入葡萄糖、玫瑰紅鈉，分裝．滅菌。
3.酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基（YPD )
腖 10.0g
瓊脂 14.0g
酵母浸出粉 5.0g
水 1000ml
葡萄糖 20.0g
除葡萄糖外，取上述成分．混合，微溫溶解，濾過，加人葡萄糖，分裝．滅菌。
4．膽鹽乳糖培養基(BL )腖20.0g
磷酸二氫鉀 1.3g
乳糖 5.0g
牛膽鹽 2.0g
氯化鈉 5.0g
（或去氧膽酸鈉） ( 0.5g)
磷酸氫二鉀 4.0g
水 1000ml
除乳糖、牛膽鹽或去氧膽酸鈉外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH值使滅菌後為7.4 ±0.2，煮沸，濾清，加人乳糖、牛膽鹽或去氧膽酸鈉，分裝，滅菌。
5.乳糖膽鹽發酵培養基
腖 20.0g
0.04%溴甲酚紫指示液 25ml
乳糖 10.0g
水 l000ml
牛膽鹽 5.0g
除0.04%溴甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH值使滅菌後為7.4 ±0.2，加人0.04%溴甲酚紫指示液，根據要求的用量分裝於含倒管的試管中。滅菌。所用倒管的規格應保證產氣結果的觀察。
6．曙紅亞甲藍瓊脂培養基（EMB )
營養瓊脂培養基 100ml
曙紅鈉指示液 2ml
20%乳糖溶液 5ml
亞甲藍指示液 1.3～1.6ml
取營養瓊脂培養基，加熱溶化後，冷至60℃，按無菌操作加入滅菌的其他3種溶液，搖勻，傾注平皿。
7.麥康凱瓊脂培養基（MacC）腖20.0g
1%中性紅指示液 3ml
乳糖 10.0g
瓊脂 14.0g
牛膽鹽 5.0g
水 l000ml
氯化鈉 5.0g
除乳糖、1%中性紅指示液、牛膽鹽及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH值使滅菌後為7.2 ±0.2，加入瓊脂，加熱溶化後，再加入其餘各成分，搖勻，分裝，滅菌，冷至約60℃，傾注平皿。
8.4 -甲基傘形酮葡糖昔酸（4-methylumbelliferyl-β-D-glucuionide，MUG）培養基
腖 10.0g
磷酸二氫鉀（無水） 0.9g
硫酸錳 0.5mg
磷酸氫二鈉（無水） 6.2g
硫酸鋅 0.5mg
亞硫酸鈉 40mg
硫酸鎂 0.1g
去氧膽酸鈉 1.0g
氯化鈉 5.0g
MUG 75mg
氯化鈣 50mg
水 l000ml
除MUG外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH值使滅菌後為7.3±0.1，加人MUG，溶解，每管分裝5ml，滅菌。
9.三糖鐵瓊脂培養基（TSI )
腖 20.0g
牛肉浸出粉 5.0g
乳糖 10.0g
蔗糖 10.0g
葡萄糖 1.0g
氯化鈉 5.0g
硫酸亞鐵 0.2g
硫代硫酸鈉 0.2g
0.2%酚磺酞指示液 12.5ml
瓊脂 12.0g
水 1000ml
除三種糖、0.2%酚磺酞指示液、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH值使滅菌後為7.3±0.1,加入瓊脂，加熱溶化後，再加入其餘各成分，搖勻，分裝，滅菌，製成高底層（2～75px）短斜面。
10．四硫磺酸鈉亮綠培養基（TTB）
腖 5.0g
硫代硫酸鈉 30.0g
牛膽鹽 1.0g
水 l000ml
碳酸鈣 10.0g
取上述成分，混合，微溫溶解，滅菌。
臨用前，取上述培養基，每10ml加入碘試液0.2ml和亮綠試液0.lml，混勻。
11.沙門、志賀菌屬瓊脂培養基（SS）
腖 5.0g
硫代硫酸鈉 8.5g
牛肉浸出粉 5.0g
中性紅指示液 2.5ml
乳糖 10.0g
亮綠試液 0.33ml
牛膽鹽 8.5g
瓊脂 16.0g
枸櫞酸鈉 8.5g
水 1000ml
枸櫞酸鐵銨 1.0g
除乳糖、中性紅指示液、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH值使滅菌後為7.2±0.1,濾過，加入瓊脂，加熱溶化後，再加入其餘各成分，搖勻，滅菌，冷至60℃，傾注平皿。
12．膽鹽硫乳瓊脂培養基（DHL )
腖 20.0g
枸櫞酸鈉 1.0g
牛肉浸出粉 3.0g
枸櫞酸鐵銨 1.0g
乳糖 10.0g
中性紅指示液 3ml
蔗糖 10.0g
瓊脂 16.0g
去氧膽酸鈉 1.0g
水 l000ml
硫代硫酸鈉 2.3g
除糖、指示液及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH值使滅菌後為7.2±0.1,加入瓊脂，加熱溶化後，再加人其餘成分，搖勻，冷至60 ℃，傾注平皿。
13.溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基
腖 10.0g
溴化十六烷基三甲銨 0.3g
牛肉浸出粉 3.0g
瓊脂 14.0g
氯化鈉 5.0g
水 l000ml
除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH值使滅菌後為7.5±0.1，加入瓊脂，加熱溶化後，分裝，滅菌，冷至60 ℃，傾注平皿。
14．亞碲酸鹽肉湯培養基
臨用前，取滅菌的營養肉湯培養基，每100ml中加人新配製的1%亞諦酸鈉（鉀）試液0.2ml，混勻，即得。
15．卵黃氯化鈉瓊脂培養基
腖 6.0g
10%氯化鈉卵黃液 100ml
牛肉浸出粉 1.8g
瓊脂 14.0g
氯化鈉 30.0g
水 650ml
除10 %氯化鈉卵黃液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH值使滅菌後為7.6土0 .1，滅菌，待冷至約60 ℃，以無菌操作加入10%氯化鈉卵黃液，充分振搖，傾注平皿。
10%氯化鈉卵黃液的制備取新鮮雞蛋1個，以無菌操作取出卵黃，放入10%無菌氯化鈉溶液100ml中，充分振搖，即得。
16.甘露醇氯化鈉瓊脂培養基
腖 10.0g
酚磺酞指示液 2.5ml
牛肉浸出粉 1.0g
瓊脂 14.0g
甘露醇 10.0g
水 l000ml
氯化鈉 75.0g
除甘露醇、酚磺酞指示液及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節州值使滅菌後為7.4 ±0.2，加入瓊脂，加熱溶化後，濾過，分裝，滅菌，冷至60 ℃，傾注平皿。
17．乳糖發酵培養基
腖 20.0g
乳糖 10.0g
0.04%溴甲酚紫指示液 25ml
水 l000ml
除0.04%溴甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH值使滅菌後為7.2±0.2，加入指示液，分裝於含倒管的小試管中，每管3ml．滅菌。
18．綠膿菌素（Pyocyanin）測定用培養基（PDP瓊脂培養基）
腖 20.0g
甘油 l0ml
氯化鎂（無水） 1.4g
瓊脂 14.0g
硫酸鉀（無水） 10.0g
水 1000ml
取腖、氯化鎂、硫酸鉀和水混合，微溫溶解，調節pH值使滅菌後為7.3±0.1，加入甘油及瓊脂，加熱溶化，混勻，分裝於試管，滅菌，置成斜面。
19.梭菌增菌培養基
牛肉浸出粉 10.0g
鹽酸半胱氨酸 0.5g
腖 10.0g
氯化鈉 5.0g
酵母浸出粉 3.0g
醋酸鈉 3.0g
可溶性澱粉 1.0g
瓊脂 0.5g
葡萄糖 5.0g
水 1000ml
取上述成分，混合，加熱煮沸使溶解，調節pH值使滅菌後為6.8士0.2，加熱溶化，濾過，分裝，滅菌。
20.哥倫比亞瓊脂培養基
酪蛋白胰酶消化物 10.0g
肉胃酶消化物 5.0g
心胰酶消化物 3.0g
酵母浸出粉 5.0g
玉米澱粉 1.0g
氯化鈉 5.0g
瓊脂 15.0g
水 1000ml
除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH值使滅菌後為7.3士0.2，加入瓊脂，加熱溶化，濾過，分裝，滅菌，冷至45～50 ℃，加人相當於20mg慶大黴素的無菌硫酸慶大黴素，混勻，傾注平皿。
21．沙氏葡萄糖液體培養基
腖 10g
葡萄糖 40g
水 1000ml
除葡萄糖外，取上述成分，混合，微溫溶解，濾過。加人葡萄糖，溶解，分裝，滅菌。
22．沙氏葡萄糖瓊脂培養基
腖 10g
水 1000ml
葡萄糖 40g
瓊脂 14g
除瓊脂和葡萄糖外，混合，微溫溶解，濾過。加入瓊脂和葡萄糖，溶解，分裝，滅菌。
23.（科瑪嘉）念珠菌顯色培養基（注1）
腖 10.2g
瓊脂 15g
氫罌素 0.5g
滅菌水 1000ml
色素 22.0g
除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH值至6.3士0.2。濾過，加入瓊脂，加熱煮沸，不斷攪拌至瓊脂完全溶解，傾注平皿。
24.1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養基
黃色玉米粉 40g
瓊脂 10～15g
聚山梨酯80 10ml
水 1000ml
取玉米粉、聚山梨酯80及蒸餾水500ml，混合，65℃加熱30分鍾，混勻，用紗布濾過，補足原水量。取瓊脂，水500ml，混合，加熱溶解。將以上兩種溶液混合，搖勻，分裝，滅菌。

7. 中國葯典微生物限度檢查法的供試品檢查

計數方法包括平皿法和薄膜過濾法。檢查時，按已驗證的計數方法進行供試品的細菌、黴菌及酵母菌菌數的測定。
按計數方法的驗證試驗確認的程序進行供試液制備。用稀釋液稀釋成1:10、1:l0²、l:10³等稀釋級的供試液。 根據菌數報告規則取相應稀釋級的供試液1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，注人15～20ml溫度不超過45 ℃的溶化的營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基或酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基，混勻，凝固，倒置培養。每稀釋級每種培養基至少制備2個平板。
陰性對照試驗
取試驗用的稀釋液1ml，置無菌平皿中．注入培養基，凝固，倒置培養。每種計數用的培養基各制備2個平板，均不得有菌生長。
培養和計數
除另有規定外，細菌培養3天，黴菌、酵母菌培養5天，逐日觀察菌落生長情況，點計菌落數，必要時，可適當延長培養時間至7天進行菌落計數並報告。菌落蔓延生長成片的平板不宜計數。點計菌落數後，計算各稀釋級供試液的平均菌落數，按菌數報告規則報告菌數。若同稀釋級兩個平板的菌落平均數不小於15．則兩個平板的菌落數不能相差l倍或以上。
一般營養瓊脂培養基用於細菌計數；玫瑰紅鈉瓊脂培養基用於黴菌及酵母菌計數；酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基用於酵母菌計數。在特殊情況下．若營養瓊脂培養基上長有黴菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養基上長有細菌，則應分別點計黴菌和酵母菌、細菌菌落數。然後將營養瓊脂培養基上的黴菌和酵母菌數或玫瑰紅鈉瓊脂培養基上的細菌數，與玫瑰紅鈉瓊脂培養基中的黴菌和酵母菌數或營養瓊脂培養基中的細菌數進行比較，以菌落數高的培養基中的菌數為計數結果。
含蜂蜜、王漿的液體制劑，用玫瑰紅鈉瓊脂培養基測定黴菌數，用酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基測定酵母菌數，合並計數。
菌數報告規則
細菌、酵母菌宜選取平均菌落數小於300cfu、黴菌宜選取平均菌落數小於100cfu的稀釋級，作為菌數報告（取兩位有效數字）的依據。以最高的平均菌落數乘以稀釋倍數的值報告1g、lml或10cm²供試品中所含的菌數。
如各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數小於1時，以<1乘以最低稀釋倍數的值報告菌數。 採用薄膜過濾法，濾膜孔徑應不大於0.45μm，直徑一般為50mm，若採用其他直徑的濾膜．沖洗量應進行相應的調整。選擇濾膜材質時應保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應採用適宜的方法滅菌。使用時，應保證濾膜在過濾前後的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和濾器在使用前應充分乾燥。為發揮濾膜的最大過濾效率，應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經薄膜過濾後，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml。總沖洗量不得超過1000ml.， 以避免濾膜上的微生物受損傷。
取相當於每張濾膜含lg、lml或10cm²供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過濾。若供試品每1g、lml或10cm²所含的菌數較多時，可取適宜稀釋級的供試液lml進行試驗。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗方法和沖洗量同「計數方法的驗證」。沖洗後取出濾膜，菌面朝上貼於營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基或酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基平板上培養。每種培養基至少制備一張濾膜。
陰性對照試驗
取試驗用的稀釋液lml，照上述薄膜過濾法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。
培養和計數
培養條件和計數方法同平皿法，每片濾膜上的菌落數應不超過100cfu。
菌數報告規則
以相當於1g、lml或10cm²供試品的菌落數報告菌數；若濾膜上無菌落生長，以<1報告菌數（每張濾膜過濾1g、lml或10cm²供試品），或<l乘以稀釋倍數的值報告菌數。

8. 中國葯典微生物限度檢查法的細菌、黴菌及酵母菌計數

細菌、黴菌及酵母菌計數用的培養基應進行培養基的適用性檢查，成品培養基、由脫水培養基或按處方配製的培養基均應檢查。
菌種
試驗用菌株的傳代次數不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的冷凍乾燥菌種為第0代），並採用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。
大腸埃希菌（Escherichia coli[CMCC ( B ) 44l02]
金黃色葡萄球菌（StapHylococcus aureus）[ CMCC ( B ) 26003 ]
枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis ) [ CMCC ( B ) 63501 ]
白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC ( F ) 98001〕
黑麴黴（Aspergillus niger) [ CMCC ( F ) 98003 ]
菌液制備
接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中或營養瓊脂培養基上，培養18～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中或改良馬丁瓊脂培養基上，培養24～48小時。上述培養物用0 . 9%無菌氯化鈉溶液製成每lml含菌數為50～100cfu的菌懸液。接種黑麴黴的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基上，培養5～7天，加人3～5ml含0.05 % ( ml /ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然後，採用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05 % ( ml / ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液製成每lml含孢子數50～100cfu的孢子懸液。
菌液制備後若在室溫下放置，應在2小時內使用；若保存在2～8 ℃，可在24小時內使用。黑麴黴孢子懸液可保存在2～8 ℃，在驗證過的貯存期內使用。
適用性檢查
取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌各50～100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注營養瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置30～35 ℃培養48小時，計數；取白色念珠菌、黑麴黴各50～100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置23～28 ℃培養72小時，計數；取白色念珠菌50～100cfu，注入無菌平皿中，立即傾注酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基．平行制備2個平皿，混勻，凝固，置23～28 ℃培養72小時，計數。同時，用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述試驗。
結果判定
若被檢培養基上的菌落平均數不小於對照培養基上的菌落平均數的70 %，且菌落形態大小與對照培養基上的菌落一致，判該培養基的適用性檢查符合規定。 當建立產品的微生物限度檢查法時，應進行細菌、黴菌及酵母菌計數方法的驗證，以確認所採用的方法適合於該產品的細菌、黴菌及酵母菌數的測定。若產品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時，計數方法應重新驗證。
驗證時，按供試液的制備和細菌、黴菌及酵母菌計數所規定的方法及下列要求進行。對各試驗菌的回收率應逐一進行驗證。
菌種及菌液制備
同計數培養鑒的適用性檢查。
驗證方法
驗證試驗至少應進行3次獨立的平行試驗，並分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。
( l )試驗組平皿法計數時，取試驗可能用的最低稀釋級供試液lml和50～100cfu試驗菌，分別注人平皿中，立即傾注瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。薄膜過濾法計數時，取規定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最後一次的沖洗液中加人50～100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數。
( 2 )菌液組測定所加的試驗菌數。
( 3 )供試品對照組取規定量供試液，按菌落計數方法測定供試品本底菌數。
( 4 )稀釋劑對照組若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時，應增加稀釋劑對照組，以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。試驗時，可用相應的稀釋液替代供試品，加入試驗菌，使最終菌濃度為每lml供試液含50～100cfu，按試驗組的供試液制備方法和菌落計數方法測定其菌數。
結果判斷
在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌數回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數占菌液組的平均菌落數的百分率）應均不低於70 %。若試驗組的菌數回收率（試驗組的平均菌落數減去供試品對照組的平均菌落數的值占菌液組的平均菌落數的百分率）均不低於70%，照該供試液制備方法和計數法測定供試品的細菌、黴菌及酵母菌數；若任一次試驗中試驗組的菌數回收率低於70 %，應採用培養基稀釋法、離心沉澱法、薄膜過濾法、中和法（常見干擾物的中和劑或滅活方法見表1）等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，並重新進行方法驗證。
表l 常見干擾物的中和劑或滅活方法 干擾物 可選用的中和劑或滅活方法 戊二醛 亞硫酸氫鈉 酚類、乙醇、吸附物 稀釋法 醛類 稀釋法、甘氨酸、硫代硫酸鹽 季銨類化合物（QACs）、對羥基苯甲酸酯卵磷脂、聚山梨酯 汞類制劑 亞硫酸氫鈉、巰基乙酸鹽、硫代硫酸鹽 雙胍類化合物 卵磷脂 碘酒、洗必泰類 聚山梨酯 鹵化物 硫代硫酸鹽 乙二胺四乙酸（EDTA ) 鎂或鈣離子 磺胺類 對氨基苯甲酸 β-內醯胺類抗生素 β-內醯胺酶 若沒有適宜的方法消除供試品的抑菌活性，那麼驗證試驗中微生物回收的失敗可看成是因供試品的抗菌活性引起的，同時表明該供試品不能被試驗菌污染。但是，供試品也可能僅對試驗用菌株具有抑製作用，而對其他菌株沒有抑製作用。因此，根據供試品須符合的微生物限度標准和菌數報告規則，在不影響檢驗結果判斷的前提下，應採用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行方法驗證試驗。若驗證試驗符合要求，應以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進行供試品檢驗。
計數方法驗證時，採用上述方法若還存在一株或多株試驗菌的回收率達不到要求，那麼選擇回收率最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢驗。
驗證試驗也可與供試品的細菌、黴菌及酵母菌計數同時進行。

9. 中國葯典微生物限度檢查法的概述

《中國葯典》2010版一抄部、二部、三部襲附錄的微生物限度檢查法內容無差別，故此文方法，以《中國葯典》2010版二部附錄ⅪJ為例。
微生物限度檢查應在環境潔凈度10000 級下的局部潔凈度100 級的單向流空氣區域內進行。檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止再污染。單向流空氣區域、工作檯面及環境應定期按《醫葯工業潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標准進行潔凈度驗證。
供試品檢查時，如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑，應證明其有效性及對微生物無毒性。
除另有規定外，本檢查法中細菌及控制菌培養溫度為30℃～35℃；黴菌、酵母菌培養溫度為23℃～28℃。
檢驗結果以1g、1ml、10g、10ml、10c㎡ 為單位報告，特殊品種可以最小包裝單位報告。
註：《醫葯工業潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標准分為GB/T16292-2010 醫葯工業潔凈室(區)懸浮粒子的測試方法GB/T16293-2010 醫葯工業潔凈室(區)浮游菌的測試方法GB/T16294-2010 醫葯工業潔凈室(區)沉降菌的測試方法