已溶於水的DNA怎麼在純化

❶ DNA的分離和純化的問題！！請教！！

氯仿除去蛋白：氯仿是非極性分子，水是極性分子，當蛋白水溶液與氯仿混合時，蛋白質分子之間的水分子就被氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態而變性。經過離心，變性蛋白質的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉澱在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機溶劑比重更大，保留在最下層。加入異戊醇能降低分子表面張力，能減少抽提過程中的泡沫產生。同時異戊醇有助於分相，使離心後的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩定。
加預冷的乙醇：冷的乙醇沉澱能力更強。乙醇沉澱DNA的機理是，DNA溶液是DNA以水合狀態穩定存在，當加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易於聚合。
SDS：SDS只是陽離子表活性劑，是蛋白質，特別是膜蛋白的變性劑。在基因組DNA提取中，SDS只是起破碎細胞游離核酸的作用，無法使DNA與蛋白質分離的。只有在鹼裂解法提取質粒DNA，通過高鹽（醋酸鉀或醋酸鈉）及低pH（4.5左右）中和下，SDS會沉澱，SDS沉澱過程中使得變性的DNA共沉澱，而經過中和復性的質粒DNA則不會沉澱，再通過離心即可把質粒DNA與基因組DNA及蛋白質分離。
RNase是RNA酶，能特定消化RNA，而不是蛋白質。
核酸分子（DNA或RNA）由於含有嘌吟環和嘧啶環的共軛雙鍵，在260 nm波長處有特異的紫外吸收峰，其吸收強度與核酸的濃度成正比，這個物理特性為測定核酸溶液濃度提供了基礎。蛋白質分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵，使蛋白質具有吸收紫外光的性質。吸收高峰在280nm 處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質含量成正比。紫外分光光度法不但能確定核酸的濃度，還可通過測定260nm和280nm的紫外線吸收值的比值（A260/A280）估計核酸的純度，純的DNA製品的比值為1.8，RNA的比值為2.0, 若DNA高於1.8,則可能有RNA污染，低於1.8則有蛋白質污染。
現在試劑盒是很普及的，使用試劑盒基本上不再需要酚，氯仿等有機溶劑。國內很多廠家都有產，本人使用過廣州捷倍斯生物產的感覺就很不錯。

❷ dna產物純化試劑盒可以純化甲基化之後的dna嗎

dna產物純化試劑盒可以純化甲基化之後的dna
1、DNA提取問題：現在核算提取試劑盒大版部分都是吸附柱法權,相信你應該不會操作錯誤,如果提取之後進行核酸定量結果很低的話,試著再最後一步溶解核算的時候把水稍微加溫（37℃就可以了）,溶解時間稍微長一些,然後再離心的時候採用分次離心,比如開始你用200ul溶解的話,你可以分兩次用100ul水溶解離心,這樣可以提高DNA的產率.
2、電泳問題：如果你核酸定量濃度不低的話就考慮電泳問題,電泳的時候加上1kb的marker,如果marker跑不出來說明你凝膠有問題,一般只要marker跑出來了,DNA濃度又比較高,而沒有條帶這樣的現象很少見,DNA提取比較簡單而且相當穩定,本人當時做甲基化提取的DNA有一次拿出來電泳忘了放回冰箱了,結果大夏天的在外面放了一天,心懷忐忑的進行了一次電泳,結果條帶依然給力,一點都沒有降解.

❸ DNA,純化,表達,連接.

DNA 純化
在生物技術實驗中，我們粗提取的DNA需分離純化去處蛋白質等雜質，我們都需要將最終的結果在瓊脂糖凝膠， 或PAGE凝膠上走電泳觀察，以判斷我們實驗的正確性以及DNA片段的完整性。同時通過紫外分光光度計測定OD260,OD280的吸收值，以確定DNA的濃度和純度。
核酸經凝膠電泳後，在EB（溴化乙錠）中浸染，核酸分子與溴化乙錠結合後， 能吸收300-360mm波長的紫外光，同時誘發出液長為590nm的紅橙色熒光，從而可通過照像機攝影，凝膠成像系統記錄實驗結果。DNA濃度的計算根據郎伯-比爾定理（E=abc）計算。根據經驗1OD260=0.05ug/ul DNA。DNA純度的判斷根據OD260/OD280的比值判斷，符合要求純度高的純化DNA其OD260/OD280在1.6-1.8之間，低於此范圍表明蛋白質含量超標，高於此范圍表明樣品中含有RNA。
實驗試劑及器材
酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）
70％乙醇 TE buffer
RNase
瓊脂糖
TBE電泳緩沖液
電泳設備
紫外分光光度計
凝膠成像系統
1. 加入RNase至終濃度10μg/ul 37℃反應1小時。
2. 加入酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）等體積各抽提2-3次，取上清。
3. 加入1/10倍體積3M NaAc(pH5.2)，2倍體積無水乙醇混勻，－20℃下10min-30min。
4. 15000rpm，離心10分鍾。
5. DNA沉澱用 70％乙醇洗2次， 37℃烘乾DNA（無乙醇）。
6. 100μl TE buffer溶解沉澱
7 取20ul DNA母液稀釋至1000μl，在紫外分光光度計上測OD260,OD280。
8. 取10 ul DNA, 在 0.8％瓊脂糖凝膠120伏，1-2小時電泳，
9. 在凝膠成像系統上記錄和分析結果。

DNA 連接
DNA分子的體外連接就是在一定條件下， 由DNA連接酶催化兩個雙鏈DNA片段組鄰的5』端磷酸與3』端羥基之間形成磷酸酸脂鍵的生物化學過程， DNA分子的連接是在酶切反應獲得同種酶互補序列基礎上進行的。
帶有相同末端(平端或粘端)的外源DNA必須克隆到具有匹配末端的線性質粒載體中,但是在連接反應時,外源DNA和質粒都可能發生環化,也有可能形成串聯寡聚物。因此，必須仔細調整連接反應中兩個DNA 的濃度，以便使「正確」連接產物的數量達到最佳水平，此外還常常使用鹼性磷酸酶去除5』磷酸基團以抑制載體DNA的自身環化。利用T4 DNA連接酶進行目的DNA和載體的體外連接反應，也就是在雙鏈DNA 5』磷酸和相鄰的3』羥基之間形成新的共價鍵。如載體的兩條鏈都帶有5』磷酸（未脫磷），可形成4個新的磷酸二酯鍵；如載體DNA已脫磷，則只能形成2個新的磷酸二酯鍵，此時產生的重組DNA帶有兩個單鏈缺口，在導入感受態細胞後可被修復。
1、 不對稱粘性末端：兩種限制酶消化後，需純化載體以提高連接效率；載體與外源DNA連接處的限制酶切位點常可保留；非重組克隆的背景較低；外源DNA可以定向插入到載體中。
2、 對稱性粘性末端；線形載體DNA常需磷酸酶脫磷處理；載體與外源DNA連接處的限制酶切位點常可保留；重組質粒會帶有外源DNA的串聯拷貝；外源DNA會以兩個方向插入到載體中。
3、 平端：要求高濃度的DNA和連接酶；載體與外源DNA連接處的限制酶切位點消失；重組質粒會帶有外源DNA的串聯拷貝；非重組克隆的背景較高 。
粘性末端連接：
實驗試劑：
用適當的限制酶消化質粒和外源DNA。如有必要，可用凝膠電泳分離片段並（或）用鹼性磷酸酶處理質粒DNA。通過酚：氯仿抽提和乙沉澱來純化DNA，然後用TE(pH7.6)溶液使其濃度為100/ml。
10×T4DNA連接酶buffer（該緩沖液應分裝成小份，貯存於－20℃。）：200mMTris-HCl(pH7.6)；50mMMgCl2；50mM二硫苄糖醇；
500μl/ml BSA（可用可不用）
T4DNA連接酶
5mM ATP

實驗步驟：
1、 在無菌Eppendorf管中加入以下溶液：
1) 10μl體積反應體系中：取載體50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般線性載體DNA分子與外源DNA分子摩爾數為1∶1-1∶5），補足ddH2O 至8μl。
2) 輕輕混勻，稍加離心，於45℃水浴5分鍾使重新退火的粘端解鏈， 迅速將混合物轉入冰浴。
3) 加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA連接酶合適單位， 用ddH2O 補至10μl。
2、 蓋上管蓋，充分混勻，台式離心扣上離心5秒。
3、 12℃下過夜連接反應。
4、 反應結束後於－20℃保存。
5、 再設立兩個對照反應，其中含有（1）只有質粒載體；（2）只有外源DNA片段。如果外源DNA量不足，每個連接反應可用50-100ng質粒DNA，並盡可能多加外源DNA，同時保持連接反應體積不超過10μl。可用至少3種不同方法來測定T4噬菌體DNA連接酶的活性。

注意事項：
1、 連接反應的溫度：DNA連接酶的最適反應溫度為37℃，但在此溫度下， 粘性末端的氫鍵結合很不穩定，折衷方法是12℃過夜。
2、 DNA的平未端和粘性末端：由於內切酶產生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而連接反應中就有平未端連接和粘性末端連接。 二者連接效率不同。粘性末端效率高，因而在底物濃度，酶濃度選擇上是有差異的。
3、 鹼性磷酸酶處理質粒載體：為了提高連接效率，一般採取提高DNA的濃度，增加重組子比例。這樣就會出現DNA自生連接問題， 為此通常選擇對質粒載體用鹼性磷酸酶處理，除去其5』末端的磷酸基，防止環化， 通過接反應後形成的缺口可在轉化細胞後得以修復。
4、 連接反應的檢測：連接反應成功與否，最後的檢測要通過下一步實驗，轉化宿主菌， 陽性克隆的篩選來確定。
5、 如果要檢驗連接酶和連接酶專用的緩沖液是否有效，可重新連接酶切後的λDNA。若連接成功，則說明有效。

原核表達
將克隆化基因插入合適載體後導入大腸桿菌用於表達大量蛋白質的方法一般稱為原核表達。這種方法在蛋白純化、定位及功能分析等方面都有應用。大腸桿菌用於表達重組蛋白有以下特點：
易於生長和控制；用於細菌培養的材料不及哺乳動物細胞系統的材料昂貴；有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質粒可供選擇。但是，在大腸桿菌中表達的蛋白由於缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯後加工，常形成包涵體而影響表達蛋白的生物學活性及構象。
表達載體在基因工程中具有十分重要的作用，原核表達載體通常為質粒，典型的表達載體應具有以下幾種元件：
（1）選擇標志的編碼序列；
（2）可控轉錄的啟動子；
（3）轉錄調控序列(轉錄終止子，核糖體結合位點)；
（4）一個多限制酶切位點接頭；
（5）宿主體內自主復制的序列。
原核表達一般程序如下：
獲得目的基因－准備表達載體－將目的基因插入表達載體中（測序驗證）－轉化表達宿主菌－誘導靶蛋白的表達－表達蛋白的分析－擴增、純化、進一步檢測

真核表達
異源蛋白質在細菌中表達是目前使用的主要的蛋白生產系統。大腸桿菌一直是最經濟的系統之一。然而為了生產需要特異修飾、胞外分泌或有特異折疊需要的蛋白質，其他表達系統也是需要的。真核細胞在表達原核來源的基因、真核基因的cDNA拷貝或其他無內含子的基因時可能表現很多特異問題。富含AT的基因在很多真核細胞中表達時會遭遇很劇烈的障礙。主要的真核信號序列如 加poly-A的位點、酵母轉錄終止位點和真核mRNA去穩定序列都是富含AT的。內含子序列也趨向於富含AT，盡管他們有參與剪切過程的很特異的識別序列。雖然絕大多數原核基因沒有剪切或聚腺苷過程，但這些真核過程需要的保守序列可能存在於原核基因中，因此當這些基因在真核細胞中表達時可能引起特異的問題。而且諸如哺乳動物和單子葉植物細胞的特異真核表達系統可能不能有效地表達無內含子的基因。
真核mRNA在離開細胞核進而在胞漿的核糖體上被翻譯前需要特異的處理和修飾。這些過程包括去除內含子、5'端甲基化帽子形成和3'端加poly-A。內含子去除需要5'剪切位點、G75/G100U100A65AG65U保守序列、3'剪切位點、富含密啶NC66A100G100/G56保守序列和C72T98R77A100Y75保守序列。有效的加poly-A和mRNA剪切需要一個由兩個部分組成的信號：加poly-A保守序列AAUAAA和在切割位點內的50個鹼基的富含GT的序列。酵母真核轉錄終止序列（幾個不同的富含AT序列,如含TTTTTATA，TATATA，TACATA，TAGTAGTA的一個38bp區域）被研究的最清楚。這些結果來自對酵母突變體CYCI mRNA的mRNA水平和相對長度的確定的實驗。近期用in vivo質粒穩定性分析的研究結果證明：TATATA似乎和原始的38bp野生型區域一樣有效地終止轉錄，而TAGATATATATGTAA和TACATA效率差些，TTTTTTTATA幾乎沒有效率。所有這些序列在反方向時沒有終止轉錄功能。不幸的是幾乎沒有其他真核表達系統轉錄終止序列方面的信息。
內含子對幾個哺乳動物基因的正常表達是必需的，包括Beta-球蛋白、SV40 late mRNA和二氫葉酸還原酶基因。單子葉植物細胞充分表達乙醇脫氫酶的cDNA拷貝、報告基因氯黴素乙醯轉移酶、Beta葡萄糖苷酸酶和其他缺乏內含子的基因時也依賴內含子。轉錄區域內引入內含子可以通過未確定的轉錄後機制增強表達。（免疫球蛋白基因）內含子可能也包含轉錄增強子，因此通過轉錄機制增強表達。

❹ 乙醇在核酸純化中的作用

洗滌沉澱啊
主要是鹽離子的去除
達到純化DNA的目的

❺ 純化dna的方法有哪些

純化DNA的常用方法是用酚抽提-乙醇沉澱法，適用於普通實驗室操作。它通過交替使用苯酚、氯仿兩種不同的蛋白質變性劑，可以增加去除蛋白質雜質的效果；氯仿可以去除核酸溶液中的微量酚，還可以加快有機相與液相混合，去除色素和蔗糖；在氯仿中加入少量的異戊醇可以減少蛋白質變性操作過程中產生的氣泡。
【實驗材料】
待純化的DNA溶液。
【實驗儀器】
高壓滅菌鍋，渦旋混勻器，台式高速冷凍離心機
【試劑配製】
1、Tris飽和酚（pH8.0）：氯仿：異戊醇混合液
酚：氯仿：異戊醇按體積比25：24：1配製，現配現用。
2、氯仿：異戊醇混合液
氯仿：異戊醇按體積比24：1配製，現配現用。
3、醋酸鈉溶液
配製3 mol／L的醋酸鈉溶液，調節pH值至5.2。
4、TE緩沖液
10 mmol／L Tris·HCl（pH 8.0），1 mmol／LEDTA（pH 8.0），配製完成後高壓滅菌，4 ℃保存。
【實驗步驟】
1、在待純化的DNA溶液中加等體積的酚：氯仿：異戊醇混合液，然後在渦旋混勻器上充分混勻。
2、將混合物12000 r／min離心10 min後，移取上層含DNA的水相到另一離心管中。如果在水相和有機相交界處有白色沉澱物，則需要重新抽提水相，直到兩相交界處無明顯沉澱物。
3、向上層水相中加入等體積的氯仿：異戊醇（24：1）混合液，在渦旋混勻器上充分混勻後12000 r／min離心10 min。
4、移取上層含DNA的水相到另一離心管中，加1／10體積的醋酸鈉溶液，充分混勻，再向管中加入2.5倍體積的預冷無水乙醇，上下倒置混勻，於-20 ℃保存30 min。
5、12000 r/min離心5 min，棄上清液；75%的乙醇12000 r/min離心洗滌5 min，棄上清液；用吸頭將管壁殘留的乙醇去除，室溫乾燥10-15 min（不要等DNA沉澱完全乾燥，否則DNA不易溶解）。
~ 1 / 2 ~
6、在盛有乾燥DNA的離心管中加入適量TE緩沖液，溶解後在-20 ℃以下長期保存。

❻ 純化得到的DNA還能PCR嗎 如何圖稿DNA濃度

一，可以pcr。純化的本質是去除蛋白質和一些其他物質，使你的dna純度更高，所以當然內可以pcr，而且有的容時候由於dna不純，甚至會干擾pcr。
二，純化的時候會損失一些dna，只能說純度提高，但是本質上dna含量會減少，至於濃度在於你溶解dna的液體體積吧~~~
三，至於提的dna濃度不高，一般在於自己的操作（如果同樣情況下，別人可以提好），也有可能是因為材料的特殊性等，可以考慮試劑盒

❼ 怎樣將dna與rna分離純化

鹽析法
DNA和蛋白質等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同 利用這一特點 選擇適當的鹽濃度版就能使DNA充分溶解 而使雜質沉澱 或者相反 以達到分離目的 DNA在NaCl溶液中的溶權解度先增大後減小 在DNA溶解度最低時 DNA從溶液中析出 而其他雜質還留在溶液中 達到粗提取的目的
酶水解法
採用RNase（可以買）水解雜質RNA如果混入DNase酶可以採用100度加熱15min使其失活 RNase不會失活 反之採用DNase可以提取RNA 混了RNase、時加入蛋白酶K或加碘乙酸鈉

樓主別忘加滿意，祝你生活愉快！

❽ 已經溶解於無菌水的DNA怎麼再次純化

加入ctab緩沖液，調節溶液為低鹽然後離心，用高鹽溶液溶解離心管底部沉澱，加入ctab沉澱液加入乙醇，離心，倒掉上清液搞定

❾ dna純化試劑盒是不是可以用於濃縮

洗脫液復少加點就是濃縮；如果制是抽提好的DNA，可以溶解後再用異丙醇沉澱出來，過柱子-洗滌-少加洗脫液-離心（沒試過，理論上感覺可以），或者異丙醇沉澱後直接離心-洗滌-風干（不要太干）-溶解；過程中會有損失，自己酌情考慮。

❿ 如何純化pcr產物或粗提的dna

你是指跑膠、割膠然後用試劑盒純化回收嗎?
如果是的話,有以下幾個方法可能專可以提高屬回收率.
1凝膠要充分溶解.2加elution buffer溶解DNA時少加點.3用elution buffer洗脫時可以把管子里的溶液吸回來,重復一次.4溶解時延長室溫溶解時間.5PCR循環可以多幾次.6可以把兩管回收離心後,合並成一管吸附柱回收.