膜蛋白離子交換
⑴ 溶酶體膜蛋白被糖被覆蓋,糖被的作用及其體現的生物學觀點
糖被的功能為：①保護作用，其上大量極性基團可保護菌體免受乾旱損傷；可防止噬菌體的吸附和裂解；一些動物致病菌的莢膜還可保護它們免受宿主白細胞的吞噬，例如，有莢膜的Streptococcus pneumoniae（肺炎鏈球菌）就更易引起人的肺炎；又如，Klebsiellapneumoniae（肺炎克雷伯氏菌）的莢膜既可使其黏附於人體呼吸道並定植，又可防止白細胞的吞噬，故有人稱致病細菌的糖被為「糖衣炮彈」；②貯藏養料，以備營養缺乏時重新利用，如Xanthobacterspp.的糖被等；③作為透性屏障和離子交換系統，以保護細菌免受重金屬離子的毒害；④表面附著作用，例如可引起齲齒的Streptococcus salivarius（唾液鏈球菌）、S.mutans和S.sobrinus（表兄鏈球菌）就會分泌一種己糖基轉移酶，使蔗糖轉變成果聚糖，由它把細菌牢牢黏附於齒表，這時細菌發酵糖類所產生的乳酸在局部發生累積，嚴重腐蝕齒表琺琅質層，引起齲齒（據2008年統計，我國老年人的齲齒發病率為98.4%，中年人為88.1%，而據1998年統計，我國5歲兒童的齲齒率在農村為78.28%，城市為75.69%）；某些水生絲狀細菌的鞘衣狀莢膜也有附著作用，而植物致病細菌則可牢牢黏附於寄主體表；⑤細菌間的信息識別作用，如Rhizobium（根瘤菌屬）；⑥堆積代謝廢物。
⑵ 生物化學，幾種蛋白質的分離及分離原理
蛋白質的分離純化方法有：
1、沉澱，
2、電泳：蛋白質在高於或低於其等電點的溶液回中是帶電的，在電場答中能向電場的正極或負極移動。根據支撐物不同，有薄膜電泳、凝膠電泳等。
3、透析：利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法。
4、層析：
a.離子交換層析，利用蛋白質的兩性游離性質，在某一特定PH時，各蛋白質的電荷量及性質不同，故可以通過離子交換層析得以分離。如陰離子交換層析，含負電量小的蛋白質首先被洗脫下來。
b.分子篩，又稱凝膠過濾。小分子蛋白質進入孔內，滯留時間長，大分子蛋白質不能同時入孔內而徑直流出。
5、超速離心：既可以用來分離純化蛋白質也可以用作測定蛋白質的分子量。不同蛋白質其密度與形態各不相同而分開。
所以要想分離，必須得先把這幾種蛋白質的性質搞定，需要從中國期刊網上查找相關文獻，然後確定下來後再仔細組合上面的方法進行分離。
⑶ 跪求實驗方案急。關於植物小分子多肽的提取分離和分析 最好用到高效液相提取 分析的
多肽類化合物廣泛存在於自然界中，其中對具有一定生物活性的多肽的研究，一直是葯物開發的一個主要方向。生物體內已知的活性多肽主要是從內分泌腺組織器官、分泌細胞和體液中產生或獲得的，生命活動中的細胞分化、神經激素遞質調節、腫瘤病變、免疫調節等均與活性多肽密切相關。隨著現代科技的飛速發展，從天然產物中獲得肽類物質的手段也不斷得到提高。一些新方法、新思路的應用。不斷有新的肽類物質被發現應用於防病治病之中。本文介紹了近幾年肽類物質分離、分析的主要方法研究進展。
1 分離方法
採取何種分離純化方法要由所提取的組織材料、所要提取物質的性質決定。對蛋白質、多肽提取分離常用的方法包括：鹽析法、超濾法、凝膠過濾法、等電點沉澱法、離子交換層析、親和層析、吸附層析、逆流分溶、酶解法等。這些方法常常組合到一起對特定的物質進行分離純化，同時上述這些方法也是蛋白、多肽類物質分析中常用的手段，如層析、叫泳等。
1.1 高效液相色譜（HPLC）
HPLC的出現為肽類物質的分離提供了有利的方法手段，因為蛋白質、多肽的HPLC應用與其它化合物相比，在適宜的色譜條件下不僅可以在短時間內完成分離目的，更重要的是HPLC能在制備規模上生產具有生物活性的多肽。因此在尋找多肽類物質分離制備的最佳條件上，不少學者做了大量的工作。如何保持多肽活性、如何選擇固定相材料、洗脫液種類、如何分析測定都是目前研究的內容。
1．1．1 反相高效液相色譜（RP-HPLC）
結果與保留值之間的關系：利用RP-HPLC分離多肽首先得確定不同結構的多肽在柱上的保留情況。為了獲得一系列的保留系數，Wilce等利用多線性回歸方法對2106種肽的保留性質與結構進行分析，得出了不同氨基酸組成對保留系數影響的關系，其中極性氨基酸殘基在2～20氨基酸組成的肽中，可減少在柱上的保留時間；在10～60氨基酸組成的肽中，非極性氨基酸較多也可減少在柱上的保留時間，而含5～25個氨基酸的小肽中，非極性氨基酸增加可延長在柱上的保留時間。同時有不少文獻報道了肽鏈長度、氨基酸組成、溫度等條件對保留情況的影響，並利用計算機處理分析得到每種多肽的分離提取的最佳條件。
肽圖分析（Peptide Mapping）：肽圖分析是根據蛋白質、多肽的分子量大小以及氨基酸組成特點，使用專一性較強的蛋白水解酶[一般未肽鏈內切酶（endopeptidase）]作用於特殊的肽鏈位點將多肽裂解成小片斷，通過一定的分離檢測手段形成特徵性指紋圖譜，肽圖分析對多肽結構研究合特性鑒別具有重要意義。利用胰蛋白酶能特意性作用於Arg和Lys羧基端的肽鏈的性質，通過RP-HPLC法採用C18柱檢測了重組人生長激素特徵性胰肽圖譜。同時胰島素的肽圖經V8酶專一裂解也製得，並可鑒別僅相差一個氨基酸殘疾的不同種屬來源的胰島素。人類腫瘤壞死因子的單克隆抗體結構也應用酶解法及在線分析技術確定了肽圖，便於鑒定分析。此項技術已經在新葯開發中得到廣泛應用。
1.1.2 疏水作用色譜（Hydrophobic interaction chromatogrphy，HIC）
HIC是利用多肽中含有疏水基因，可與固定相之間產生疏水作用而達到分離分析的目的，其比RP-GPLC具有較少使多肽變性的特點。利用GIC分離生產激素（GH）產品的結構與活性比EP-GPLC分離的要穩定，活性較穩定。Geng等利用HIC柱的低變性特點，將大腸桿菌表達出的經鹽酸胍乙啶變性得到人重組干擾素-γ。通過HIC柱純化、折疊出高生物活性的產品。不同人尿表皮生長因子（EGF）也利用HIC純化到了，均具有良好的生物活性。HIC可將未經離子交換柱的樣品純化。而RP-HPLC則不能達到這一要求。
1.1.3 分子排阻色譜（Sizs-Exclusion chromatogrphy，SEC）
SEC是利用多肽分子大小、形狀差異來分離純化多肽物質，特別對一些較大的聚集態的分子更為方便，如人重組生長激素（hgH）的分離，不同結構、構型的GH在SEC柱上分離行為完全不同，從而可分離不同構型或在氨基酸序列上有微小差異的變異體，利用SEC研究修飾化的PEG的分離方法，此PEC具有半衰期長、作用強的特點。一些分子量較大的肽或蛋白均可利用此法分離分析。
1．1．4離子交換色譜（Iron-Exchange chromatography,IEXC）
IEXC可在中性條件下，利用多肽的帶電性不同分離純化具有生物活性的多肽。其可分為陽離子柱與陰離子柱兩大類，還有一些新型樹脂，如大孔型樹脂、均孔型樹脂、離子交換纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠樹脂等。在多肽類物質的分離分析研究中，對多肽的性質、洗脫劑、洗脫條件的研究較多，不同的多肽分離條件有所不同，特別是洗脫劑的離子強度、鹽濃度等對純化影響較大。Wu等報道利用離子交換柱層析法，探討分離牛碳酸酐異構體和牛血清白蛋白、雞血清白蛋白酶的提取條件，獲得了有價值的數據供今後此類物質分離研究。
1．1．5膜蛋白色譜（Chromatography of Membrane Protein,CMP）
CMP+分離強蔬水性蛋白、多肽混合物的層析系統，一般有去垢劑（如SDS）溶解膜蛋白後形成SDS-融膜蛋白，並由羥基磷灰石為固定相的柱子分離純化。羥基磷灰石柱具有陰離子磷酸基團（P-端），又具有陽離子鈣（C-端），與固定相結合主要決定於膜蛋白的大小、SDS結合量有關。利用原子散射法研究cAMP的分離機制發現，樣品與SDS結合後在離子交換柱上存在SDS分子、帶電荷氨基酸與固定相中帶電離子間的交換，從而達到分級分離的目的。
1．1．6高效置換色譜（High-Performance Displacement Chromatography,HPDC）
HPDC是利用小分子高效置換劑來交換色譜柱上的樣品，從而達到分離的目的。它具有分離組分含量較少成分的特性。利用HPDC鑒定分離了低於總量1%組分的活性人重組生長激素（rHG ）。在研究非毒性交換劑時Jayarama發現硫酸化葡萄糖（Detran Sulfate，DS）是對β乳球蛋白A和B的良好置換劑，一般DS的相對分子質量為1×104和4×104最宜。研究表明置換劑的相對分子質量越低，越易於與固定相結合，因此在分離相對分子質量小的多肽時，需要更小的置換劑才能將其置換純化出來。
1.1.7 灌注層析（Perfusion Chromatography，PC）
PC是一種基於分子篩原理與高速流動的流動相的層析分離方法，固定相孔徑大小及流動相速度直接影響分離效果。試驗證明其在生產、制備過程中具有低投入、高產出的特性。目前市場上可供應的PC固定相種類較多，適合於不同分子量的多肽分離使用。
1.2 親和層析（Affinity Chromatography，AC）
AC是利用連接在固定相基質上的配基與可以和其特異性產生作用的配體之間的特異親和性而分離物質的層析方法。自1968年Cuatrecasas提出親和層析概念以來，在尋找特異親和作用物質上發現了許多組合，如抗原-抗體、酶-催化底物、凝集素-多糖、寡核苷酸與其互補鏈等等。對多肽類物質分離目前主要應用其單抗或生物模擬配基與其親和，這些配基由天然的，也有根據其結構人工合成的。Patel等人利用一系列親和柱分離純化到了組織血漿纖維蛋白酶原激活劑蛋白多肽。
固定金屬親和層析（Immobilized Metal Affinity Chromatography.LMAC）是近年來發展起來的一種親和方法。其固定相基質上鰲合了一些金屬離子，如Cu2+、Ni2+、Fe3+等，此柱可通過配為鍵鰲合側鏈含有Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和His的多肽，特別是肽序列中含有His-X-X-X-His的結構最易結合到金屬離子親和柱上，純化效果較好。其中胰島素樣生長因子（Insylin Like Growth Factor，IGF）、二氫葉還原酶融合蛋白等均用此方法分離到純度較高的產品。
Chaiken等人報道了另一種親和層析方法，利用反義DNA表達產生，其與正鏈DNA表達產生的肽或蛋白具有一定的親和性，如Arg加壓素受體復合物，已用此法分離得到。DNA與蛋白、多肽復合物之間的作用也是生物親和中常用的方法。將人工合成的寡核苷酸結合在固定相基質上，將樣品蛋白或多肽從柱中流過，與之結合可達到分離特定結構多肽的目的。
1.3 毛細管電泳（Capillary electrophoresis，CE）--分離分析方法
CE是在傳統的電泳技術基礎上於本世紀60年代末由Hjerten發明的，其利用小的毛細管代替傳統的大電泳槽，使電泳效率提高了幾十倍。此技術從80年代以來發展迅速，是生物化學分析工作者與生化學家分離、定性多肽與蛋白類物質的有利工具。CE根據應用原理不同可分為以下幾種；毛細管區帶電泳Capillary Zone electrophoresis，CZE）、毛細管等電聚焦電泳（Capillary Isoeletric Focusing，CIEF）毛細管凝膠電泳（CapillaryGelElectrophoresis，CGE）和膠束電動毛細管層析（Micellar Electokinetic Electrophoresis Chromatorgraphy,MECC）等。
1.3.1 毛細管區帶電泳（Capillary Zone Electrophoresis，CZE）
CZE分離多肽類物質主要是依據不同組分中的化合物所帶電性決定，比傳統凝膠電泳更准確。目前存在於CZE分離分析多肽物質的主要問題是天然蛋白或肽易與毛細管硅膠柱上的硅醇發生反應，影響峰形與電泳時間，針對這些問題不少學者做了大量實驗進行改進，如調節電池泳液的PH值，使與硅醇反應的極性基團減少；改進毛細管柱材料的組成，針對多肽性質的不同採取不同的CZE方法研究分離5個含9個氨基酸殘基的小肽，確定了小肽分析的基本條件，即在低PH條件下，緩沖液中含有一定濃度的金屬離子如Zn2+等，此時分離速度快而且准確。
1．3．2細管等電聚電泳（Capillary Isleletric Focusing,CIEF）
由於不同的蛋白、多肽的等電點（PI）不同，因此在具有不同pH梯度的電泳槽中，其可在等電點pH條件下聚集沉澱下來，而與其他肽類分離開來。CIEF在分離、分析混合多肽物質中應用不多，主要應用與不同來源的多肽異構體之間的分離，如對rHG不同異構體分離。由於在CIEF柱表面覆蓋物的不穩定性限制了此法的廣泛應用。
1．3. 3毛細管凝膠電泳 (Capillary Gel Electrophoresis,CGE)
CGE是基於分子篩原理，經十二烷基磺酸鈉（SDS）處理的蛋白或多肽在電泳過程中主要靠分子形狀、分子量不同而分離。目前，又有一種非交聯歡、線性、疏水多聚凝膠柱被用於多肽物質的分離分析，此電泳法適於含疏水側鏈較多的肽分離，這種凝膠易於灌注，使用壽命長，性質較為穩定。
1．3．4膠束電動毛細管層析（Micellar Electrokinetic Electorphoresis Chromatography, MECC）
MECC的原理是在電泳液中加入表面活性劑，如SDS，使一些中性分子帶相同電荷分子得以分離。特別對一些小分子肽，陰離子、陽離子表面活性劑的應用都可使之形成帶有一定電荷的膠束，從而得到很好的分離效果。有文獻報道在電解液中加入環糊精等物質，可使用權含疏水結構組分的多肽選擇性與環糊精的環孔作用，從而利用疏水作用使多肽得到分離。
1．4多肽蛋白質分離工程的系統應用
以上提到的分離多肽的技術在實際應用過程中多相互結合，根據分離多肽性質的不同，採用不同的分離手段。特別是後基因組時代，對於蛋白質組深入的研究，人們對於分離多肽及蛋白質的手段不斷改進，綜合利用了蛋白質和多肽的各種性質，採用包括前面提到的常規蛋白多肽提取方法，同時利用了高效液相色譜，毛細管電泳，2-D電泳等手段分離得到細胞或組織中盡可能多的蛋白多肽。在蛋白質組學研究中系統應用蛋白和多肽分離鑒定的技術在此研究中即是分離手段也是分析方法之一。特別是以下提到的質譜技術的發展，大大的提高了蛋白多肽類物質的分析鑒定的效率。
2 分析方法
2．1 質譜分析（Mass Spectrometry, MS）
MS在蛋白、多肽分析中已經得到了廣泛應用，特別是在分離純化後的在線分析中，MS的高敏性、快速性特別適合多肽物質分析鑒定。其中連續流快原子轟擊質譜（Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB）和電霧離子化質譜（Electrospray Ionization, EIS）是近幾年發展起來的新方法。
2．1．1連續流快原子轟擊質譜（Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB）
cf-FAB是一種弱離子化技術，可將肽類或小分子量蛋白離子化成MH+或（M-H）形式。主要應用於肽類的分離檢測，其具有中等解析度，精確度大於+0.2amu，流速一般在0.5-1.5μl·Ml-1。在測定使流動相需加0.5%-10%基質如甘油和高有機溶劑成分，使樣品在檢測探針處達到敏感化。cf-FAB常與HPLC、CEZ等方法結合使用達分離分析的目的，許多多肽的cf-FAB分析方法已經建立，並得到很好的應用。如Hideaki等利用此法研究L-Pro、L-Ala的四肽化合物系列。證明L-Pro在保持小肽構相穩定性。連接分子方面具有重要意義。
2.1.2 電霧離子化質譜（Electrospray Ionozation，EIS）
EIS可產生多價離子化的蛋白或多肽，允許相對分子質量達1×105蛋白進行分析，解析度在1500-2000amu。精確度在0.01%左右。EIS更適合相對分子質量大的蛋白質的在線分析，且需要氣化或有機溶劑使樣品敏感化。利用EIS與HPLC聯合分離分析GH和血紅蛋白均獲成功，其也可與CEZ聯合應用。
2.1.3 基質輔助激光解析/離子化-飛行時間質譜（Matrix-associated laser disso-ciation/ionization time of flight mass spectrmtry，MALDI-TOF MS）
MALDI-TOF是目前蛋白質鑒定中精確測定測定分子質量的手段，特別適合對混合蛋白多肽類物質的相對分子質量的測定，靈敏度和解析度均較高。它是目前蛋白質組學研究的必備工具。同時結合液相色譜的聯用技術可以高效率的鑒定多肽物質。特別是當各種原理的質譜技術串聯應用時，不但可以得到多肽的相對分子質量信息，還可以測定它的序列結構，此項技術將在未來蛋白質組學研究中起到決定性作用。
2.2 核磁共振(Nuclear Magnetic resonance，NMR)
NMR因圖譜信號的純數字化、過度的重疊范圍過寬（由於相對分子質量太大）核信號弱等原因，在蛋白、多肽物質的分析中應用一直不多。隨著二維、三維以及四維NMR的應用，分子生物學、計算機處理技術的發展，使NMR逐漸成為此類物質分析的主要方法之一。NMR可用於確定氨基酸序列、定量混合物中的各組分組成含量等分析中。但要應用於蛋白質分析中仍有許多問題需要解決，例如，如何使分子量大的蛋白質有特定的形狀而便於定量與定性分析，如何減少數據處理的時間問題等。這些問題多有不少學者在進行研究。雖然在蛋白質分析中應用較少，NMR在分析分子中含少於30個氨基酸的小肽時是非常有用的，可以克服上述蛋白質分析中的缺點而達到快速准確分析的目的。
2.3 其他
除上述方法之外，氨基酸組成分析、氨基酸序列分析、場解析質譜、IR、UV光譜、CD、圓而色譜、生物鑒定法、放射性同位素標記法及免疫學方法等都已應用於多肽類物質的結果鑒定、分析檢測之中。
以上簡要的介紹了近幾年多肽物質分離、分析的常用方法及最新研究方向。隨著科學技術水平的不斷發展，會有許多更新的分離分析手段不斷涌現，因此這一領域的研究具有廣闊的前景。 應用SDS-PAGE顯示小分子多肽
SDS-PAGE在分離、鑒定和純化蛋白質方面有著廣泛應用，其有效分離范圍取決於聚丙烯醯胺的濃度和交聯度，其孔徑隨著雙丙烯醯胺與丙烯醯胺比率的增加而減小，比率接近於1：20時，孔徑達到最小值。分子量低於10kD的小分子肽類，即使用較高濃度的聚丙烯醯胺凝膠的SDS-PAGE也不能完全分離，或是顯不出色，或是顯帶較弱，帶型彌散。且分子量越小，效果也越差。
為了能在SDS-PAGE上顯示測定小分子量的多肽，通常採取兩種方法：一是增加凝膠的濃度和交聯度，在制膠時加入一些可以降低聚丙烯醯胺凝膠網限孔徑的溶質分子，使用尿素、甘油或蔗糖等物質；二是選擇緩沖液中的拖尾離子的種類和濃度以達到改善多肽的分離效果。
操作步驟
1．電泳緩沖液的配製如下表所示
緩沖液Tris
(mol/L)Tricine
(mol/L)pHSDS
(%)
陽極緩沖液
陰極緩沖液
膠緩沖液0.2
0.1
3.0—
0.1
—8.9*
8.25**
8.4*—
0.1
0.3
* 用HCl調pH
** pH約為8.25
2．丙烯醯胺貯存液的配製
單丙-雙丙混合物單丙的百分數雙丙的百分數
49.5% T, 3%C
49.5% T, 6%C48
46.51.5
3.0
T：丙烯醯胺的總濃度
C：交聯度
3．膠的制備，與一般SDS-PAGE相似，按下表配製分離膠和濃縮膠
組 份分離膠
16% T，6%C濃縮膠
6% T，3%C
49.5% T, 3%C丙烯醯胺溶液（ml）
49.5% T, 6%C 丙烯醯胺溶液（ml）
膠緩沖液（ml）
脲（g）[甘油（ml）]
水（ml）
10%過硫酸銨（μl）
TEMED（μl）
總體積（ml）—
3.3
3.3
3.6[2.4]
1
40
4.0
10.040.48
—
1.00
—
1.50
25
2.5
3.03
4．樣品緩沖液
4% SDS
12%甘油
50mmol/L Tris
2%巰基乙醇
0.01% Serva blue
多肽樣品與樣品緩沖液混合沸煮2min（或40℃溫浴30min）。
5．將灌膠的玻璃板固定在電泳裝置上，用1%瓊脂糖封邊，倒入陰極緩沖液，依次加樣。
6．將電泳裝置放入電泳槽內，倒入陽極緩沖液，將正負極與電泳儀相接，恆電壓50~60V，待指示劑進入分離膠後，電壓可升至70~90V，恆壓約3h待指示劑走出凝膠下緣停止電泳。
7．染色、脫色及膠的保存同SDS-PAGE。
⑷ 膜蛋白核蛋白,糖蛋白,脂蛋白異同點,及這些蛋白的分離方法和分離原理 需要詳細的答案，謝謝各位大神
膜蛋白：http://ke..com/view/145802.htm
核蛋白：http://ke..com/view/264309.htm
糖蛋白：http://ke..com/view/184084.htm
脂蛋白：http://ke..com/view/133314.htm
異同點：化學本質都是蛋白質，只不過糖蛋白有糖側鏈而已，所在位置不同，發揮的作用也不相同。
蛋白質的分離方法及原理：
根據分子大小不同進行分離純化
蛋白質是一種大分子物質,並且不同蛋白質的分子大小不同,因此可以利用一些較簡單的方法使蛋白
質和小分子物質分開,並使蛋白質混合物也得到分離。根據蛋白質分子大小不同進行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等。
2.根據溶解度不同進行分離純化
影響蛋白質溶解度的外部條件有很多,比如溶液的pH值、離子強度、介電常數和溫度等。但在同一條件下,不同的蛋白質因其分子結構的不同而有不同的溶解度,根據蛋白質分子結構的特點,適當地改變外部條件,就可以選擇性地控制蛋白質混合物中某一成分的溶解度,達到分離純化蛋白質的目的。常用的方法有等電點沉澱和pH值調節、蛋白質的鹽溶和鹽析、有機溶劑法、雙水相萃取法、反膠團萃取法等。
等電點沉澱和pH值調節是最常用的方法。每種蛋白質都有自己的等電點,而且在等電點時溶解度最
低;相反,有些蛋白質在一定pH值時很容易溶解。因而可以通過調節溶液的pH值來分離純化蛋白質。王洪新等[8]研究茶葉蛋白質提取過程發現,pH值為時茶葉蛋白提取效果最好,提取率達到36·8%,初步純化得率為91·0%。李殿寶[9]在從葵花脫脂粕中提取蛋白質時將蛋白溶液的pH值調到3~4,使目標蛋白於等電點沉澱出來。等電點沉澱法還應用於葡萄籽中蛋白質的提取。李鳳英等[10]測得葡萄籽蛋白質的等電點為3·8。他們利用鹼溶法提取葡萄籽蛋白質,得到了最佳的提取工藝為:以1×10-5mol·L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃攪拌40 min,葡萄籽蛋白質提取率達73·78%。另外還可以利用鹼法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均優於酶法提取[11]。利用酸法提取得到的鰱魚魚肉蛋白質無腥味、色澤潔白,蛋白質產率高達90%[12]。
蛋白質的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質溶解度的現象,其中,增加蛋白質溶解度的現象稱鹽溶,反之為鹽析。應當指出,同樣濃度的二價離子中性鹽,如MgCl2、(NH4)2SO4對蛋白質溶解度影響的效果,要比一價離子中性鹽如NaCl、NH4Cl大得多。在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用鹼溶法還可以利用鹽溶法來提取蛋白質,其最佳提取工藝是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃攪拌提取30min,蛋白質提取率為57·25%[10]。鹽析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法,其中硫酸銨鹽析法廣泛應用於生產。由於硫酸銨在水中呈酸性,為防止其對蛋白質的破壞,應用氨水調pH值至中性。為防止不同分子之間產生共沉澱現象,蛋白質樣品的含量一般控制在0·2% ~2·0%。利用鹽溶和鹽析對蛋白質進行提純後,通常要使用透析或者凝膠過濾的方法除去中性鹽[13]。
有機溶劑提取法的原理是:與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質在水中的溶解度顯著降低;而且在一定溫度、pH值和離子強度下,引起蛋白質沉澱的有機溶劑的濃度不同,因此,控制有機溶劑的濃度可以分離純化蛋白質。例如,在冰浴中磁力攪拌下,在4℃預冷的培養液中緩慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,從而純化冰核蛋白[14]。由於在室溫下,有機溶劑不僅能引起蛋白質的沉澱,而且伴隨著變性。因此,通常要將有機溶劑冷卻,然後在不斷攪拌下加入有機溶劑防止局部濃度過高,蛋白質變性問題就可以很大程度上得到解決。對於一些和脂質結合比較牢固或分子中極性側鏈較多、不溶於水的蛋白質,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑提取,它們有一定的親水性和較強的親脂性,是理想的提取液。冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由Cohn於1949年提出,用於制備丙種球蛋白。冷乙醇法也是目前WHO規程和中國生物製品規程推薦的方法,不僅解析度高、提純效果好、可同時分離多種血漿成分,而且有抑菌、清除和滅病毒的作用[15]。
萃取是分離和提純有機化合物常用的一種方法,而雙水相萃取和反膠團萃取可以用來分離蛋白質。雙水相萃取技術(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指親水性聚合物水溶液在一定條件下形成雙水相,由於被分離物在兩相中分配的不同,便可實現分離,被廣泛用於生物化學、細胞生物學和生物化工等領域的產品分離和提取。此方法可以在室溫環境下進行,雙水相中的聚合物還可以提高蛋白質的穩定性,收率較高。對於細胞內的蛋白質,需要先對細胞進行有效破碎。目的蛋白常分布在上相並得到濃縮,細胞碎片等固體物分布在下相中。採用雙水相系統濃縮目的蛋白,受聚合物分子量及濃度、溶液pH值、離子強度、鹽類型及濃度的影響[16]。
反膠團萃取法是利用反膠團將蛋白質包裹其中而達到提取蛋白質的目的。反膠團是當表面活性劑
在非極性有機溶劑溶解時自發聚集而形成的一種納米尺寸的聚集體。這種方法的優點是萃取過程中蛋
白質因位於反膠團的內部而受到反膠團的保護。程世賢等[17]就利用反膠團萃取法提取了大豆中的蛋白質。
3.根據電荷不同進行分離純化
根據蛋白質的電荷即酸鹼性質不同分離蛋白質的方法有電泳和離子交換層析兩類。
在外電場的作用下,帶電顆粒(如不處於等電點狀態的蛋白質分子)將向著與其電性相反的電極移動,這
種現象稱為電泳。聚丙烯醯胺電泳是一種以聚丙烯醯胺為介質的區帶電泳,常用於分離蛋白質。它的優點是設備簡單、操作方便、樣品用量少。等電聚焦是一種高解析度的蛋白質分離技術,也可以用於蛋白質的等電點測定。利用等電聚焦技術分離蛋白質混合物是在具有pH梯度的介質中進行的。在外電場作用下各種蛋白質將移向並聚焦在等於其等電點的pH值梯度處形成一個窄條帶。孫臣忠等[18]研究了聚丙烯醯胺電泳、等電聚焦電泳和等速提純電泳在分離純化蛋白質中的應用。結果發現,聚丙烯醯胺電泳的條帶解析度低,加樣量不高;等電聚焦電泳解析度最高,可以分離同種蛋白的亞成分,加樣量最小;等速提純電泳區帶解析度較高,可將樣品分成單一成分,加樣量最大。
離子交換層析(Ion exchange chromatography,IEC)是以離子交換劑為固定相,依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。離子交換層析中,基質由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的為陰離子交換樹脂;反之為陽離子交換樹脂。離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化。當蛋白質處於不同的pH值條件下,其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質,被留在層析柱上,通過提高洗脫液中的鹽濃度,將吸附在層析柱上的蛋白質洗脫下來,其中結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質,結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。李全宏等[19]將離子交換層析應用於濃縮蘋果汁中蛋白質的提純。另外,離子交換層析還用於抗凝血蛋白的提取[7]。
4. 利用對配體的特異親和力進行分離純化
親和層析是利用蛋白質分子對其配體分子特有的識別能力(即生物學親和力)建立起來的一種有效的純化方法。它通常只需一步處理即可將目的蛋白質從復雜的混合物中分離出來,並且純度相當高。應用親和層析須了解純化物質的結構和生物學特性,以便設計出最好的分離條件。近年來,親和層析技術被廣泛應用於靶標蛋白尤其是疫苗的分離純化,特別是在融合蛋白的分離純化上,親和層析更是起到了舉足輕重的作用,因為融合蛋白具有特異性結合能力[20]。親和層析在基因工程亞單位疫苗的分離純化中應用也相當廣泛[21]。范繼業等[22]利用殼聚糖親和層析提取的抑肽酶比活達到71 428 BAEE·mg-1,純化回收率達到62·5%。該方法成本較低,吸附劑價格低廉、機械強度高、抗污染能力較強、非特異性吸附較小、可反復使用、適用性廣,產品質量穩定。
⑸ 如何除去Triton-X-114
用Triton X100溶解膜蛋白抄之後怎樣襲再除去Triton是比較困難的
低CMC值的去垢劑透析效果很差，因為去垢劑膠團緩慢透過或者乾脆就不能透過透析膜。由於一些原因，超濾方法可能效率也不高。除了通透性的問題，在超濾膜的附近蛋白濃度變得很高，這容易導致大范圍聚集。在柱上進行緩沖液更換通常較緩和並且高效。
可以通過脫鹽柱，離子交換柱或者疏水柱完成膜蛋白中Triton X100的去除
⑹ 用Triton X-100溶解膜蛋白之後怎樣再把Triton除去
用Triton X100溶解膜蛋白之後怎樣再除去Triton是比較困難的
低CMC值的去垢劑透析效果很差，因回為去垢劑膠團緩慢透答過或者乾脆就不能透過透析膜。由於一些原因，超濾方法可能效率也不高。除了通透性的問題，在超濾膜的附近蛋白濃度變得很高，這容易導致大范圍聚集。在柱上進行緩沖液更換通常較緩和並且高效。
可以通過脫鹽柱，離子交換柱或者疏水柱完成膜蛋白中Triton X100的去除
⑺ 求蛋白分離純化步驟
蛋白質分離純化的一般程序可分為以下幾個步驟：
（一）材料的預處理及細胞破碎
分離提純某一種蛋白質時,首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來並保持原來的天然狀態,不喪失活性.所以要採用適當的方法將組織和細胞破碎.常用的破碎組織細胞的方法有：
1.機械破碎法
這種方法是利用機械力的剪切作用,使細胞破碎.常用設備有,高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等.
2.滲透破碎法
這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎.
3.反復凍融法
生物組織經凍結後,細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破.這種方法簡單方便,但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質不宜採用此法.
4.超聲波法
使用超聲波震盪器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎.
5.酶法
如用溶菌酶破壞微生物細胞等.
(二)蛋白質的抽提
通常選擇適當的緩沖液溶劑把蛋白質提取出來.抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據欲制備的蛋白質的性質而定.如膜蛋白的抽提,抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、tritonX-100 等）,使膜結構破壞,利於蛋白質與膜分離.在抽提過程中,應注意溫度,避免劇烈攪拌等,以防止蛋白質的變性.
（三）蛋白質粗製品的獲得
選用適當的方法將所要的蛋白質與其它雜蛋白分離開來.比較方便的有效方法是根據蛋白質溶解度的差異進行的分離.常用的有下列幾種方法：
1.等電點沉澱法
不同蛋白質的等電點不同,可用等電點沉澱法使它們相互分離.
2.鹽析法
不同蛋白質鹽析所需要的鹽飽和度不同,所以可通過調節鹽濃度將目的蛋白沉澱析出.被鹽析沉澱下來的蛋白質仍保持其天然性質,並能再度溶解而不變性.
3.有機溶劑沉澱法
中性有機溶劑如乙醇、丙酮,它們的介電常數比水低.能使大多數球狀蛋白質在水溶液中的溶解度降低,進而從溶液中沉澱出來,因此可用來沉澱蛋白質.此外,有機溶劑會破壞蛋白質表面的水化層,促使蛋白質分子變得不穩定而析出.由於有機溶劑會使蛋白質變性,使用該法時,要注意在低溫下操作,選擇合適的有機溶劑濃度.
（四）樣品的進一步分離純化
用等電點沉澱法、鹽析法所得到的蛋白質一般含有其他蛋白質雜質,須進一步分離提純才能得到有一定純度的樣品.常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等.
有時還需要這幾種方法聯合使用才能得到較高純度的蛋白質樣品.
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蛋白質分離純化的一般程序可分為以下幾個步驟：
（一）材料的預處理及細胞破碎
分離提純某一種蛋白質時，首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來並保持原來的天然狀態，不喪失活性。所以要採用適當的方法將組織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有：
1. 機械破碎法
這種方法是利用機械力的剪切作用，使細胞破碎。常用設備有，高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。
2. 滲透破碎法
這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎。
3. 反復凍融法
生物組織經凍結後，細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破。這種方法簡單方便，但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質不宜採用此法。
4. 超聲波法
使用超聲波震盪器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。
5. 酶法
如用溶菌酶破壞微生物細胞等。
(二) 蛋白質的抽提
通常選擇適當的緩沖液溶劑把蛋白質提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據欲制備的蛋白質的性質而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、tritonX-100等），使膜結構破壞，利於蛋白質與膜分離。在抽提過程中，應注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質的變性。
（三）蛋白質粗製品的獲得
選用適當的方法將所要的蛋白質與其它雜蛋白分離開來。比較方便的有效方法是根據蛋白質溶解度的差異進行的分離。常用的有下列幾種方法：
1. 等電點沉澱法
不同蛋白質的等電點不同，可用等電點沉澱法使它們相互分離。
2. 鹽析法
不同蛋白質鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過調節鹽濃度將目的蛋白沉澱析出。被鹽析沉澱下來的蛋白質仍保持其天然性質，並能再度溶解而不變性。
3. 有機溶劑沉澱法
中性有機溶劑如乙醇、丙酮，它們的介電常數比水低。能使大多數球狀蛋白質在水溶液中的溶解度降低，進而從溶液中沉澱出來，因此可用來沉澱蛋白質。此外，有機溶劑會破壞蛋白質表面的水化層，促使蛋白質分子變得不穩定而析出。由於有機溶劑會使蛋白質變性，使用該法時，要注意在低溫下操作，選擇合適的有機溶劑濃度。
（四）樣品的進一步分離純化
用等電點沉澱法、鹽析法所得到的蛋白質一般含有其他蛋白質雜質，須進一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時還需要這幾種方法聯合使用才能得到較高純度的蛋白質樣品。
⑼ 跪求實驗方案急。關於植物小分子多肽的提取分離和分析 最好用到高效液相提取的
多肽類化合物廣泛存在於自然界中，其中對具有一定生物活性的多肽的研究，一直是葯物開發的一個主要方向。生物體內已知的活性多肽主要是從內分泌腺組織器官、分泌細胞和體液中產生或獲得的，生命活動中的細胞分化、神經激素遞質調節、腫瘤病變、免疫調節等均與活性多肽密切相關。隨著現代科技的飛速發展，從天然產物中獲得肽類物質的手段也不斷得到提高。一些新方法、新思路的應用。不斷有新的肽類物質被發現應用於防病治病之中。本文介紹了近幾年肽類物質分離、分析的主要方法研究進展。
1 分離方法
採取何種分離純化方法要由所提取的組織材料、所要提取物質的性質決定。對蛋白質、多肽提取分離常用的方法包括：鹽析法、超濾法、凝膠過濾法、等電點沉澱法、離子交換層析、親和層析、吸附層析、逆流分溶、酶解法等。這些方法常常組合到一起對特定的物質進行分離純化，同時上述這些方法也是蛋白、多肽類物質分析中常用的手段，如層析、叫泳等。
1.1 高效液相色譜（HPLC）
HPLC的出現為肽類物質的分離提供了有利的方法手段，因為蛋白質、多肽的HPLC應用與其它化合物相比，在適宜的色譜條件下不僅可以在短時間內完成分離目的，更重要的是HPLC能在制備規模上生產具有生物活性的多肽。因此在尋找多肽類物質分離制備的最佳條件上，不少學者做了大量的工作。如何保持多肽活性、如何選擇固定相材料、洗脫液種類、如何分析測定都是目前研究的內容。
1．1．1 反相高效液相色譜（RP-HPLC）
結果與保留值之間的關系：利用RP-HPLC分離多肽首先得確定不同結構的多肽在柱上的保留情況。為了獲得一系列的保留系數，Wilce等利用多線性回歸方法對2106種肽的保留性質與結構進行分析，得出了不同氨基酸組成對保留系數影響的關系，其中極性氨基酸殘基在2～20氨基酸組成的肽中，可減少在柱上的保留時間；在10～60氨基酸組成的肽中，非極性氨基酸較多也可減少在柱上的保留時間，而含5～25個氨基酸的小肽中，非極性氨基酸增加可延長在柱上的保留時間。同時有不少文獻報道了肽鏈長度、氨基酸組成、溫度等條件對保留情況的影響，並利用計算機處理分析得到每種多肽的分離提取的最佳條件。
肽圖分析（Peptide Mapping）：肽圖分析是根據蛋白質、多肽的分子量大小以及氨基酸組成特點，使用專一性較強的蛋白水解酶[一般未肽鏈內切酶（endopeptidase）]作用於特殊的肽鏈位點將多肽裂解成小片斷，通過一定的分離檢測手段形成特徵性指紋圖譜，肽圖分析對多肽結構研究合特性鑒別具有重要意義。利用胰蛋白酶能特意性作用於Arg和Lys羧基端的肽鏈的性質，通過RP-HPLC法採用C18柱檢測了重組人生長激素特徵性胰肽圖譜。同時胰島素的肽圖經V8酶專一裂解也製得，並可鑒別僅相差一個氨基酸殘疾的不同種屬來源的胰島素。人類腫瘤壞死因子的單克隆抗體結構也應用酶解法及在線分析技術確定了肽圖，便於鑒定分析。此項技術已經在新葯開發中得到廣泛應用。
1.1.2 疏水作用色譜（Hydrophobic interaction chromatogrphy，HIC）
HIC是利用多肽中含有疏水基因，可與固定相之間產生疏水作用而達到分離分析的目的，其比RP-GPLC具有較少使多肽變性的特點。利用GIC分離生產激素（GH）產品的結構與活性比EP-GPLC分離的要穩定，活性較穩定。Geng等利用HIC柱的低變性特點，將大腸桿菌表達出的經鹽酸胍乙啶變性得到人重組干擾素-γ。通過HIC柱純化、折疊出高生物活性的產品。不同人尿表皮生長因子（EGF）也利用HIC純化到了，均具有良好的生物活性。HIC可將未經離子交換柱的樣品純化。而RP-HPLC則不能達到這一要求。
1.1.3 分子排阻色譜（Sizs-Exclusion chromatogrphy，SEC）
SEC是利用多肽分子大小、形狀差異來分離純化多肽物質，特別對一些較大的聚集態的分子更為方便，如人重組生長激素（hgH）的分離，不同結構、構型的GH在SEC柱上分離行為完全不同，從而可分離不同構型或在氨基酸序列上有微小差異的變異體，利用SEC研究修飾化的PEG的分離方法，此PEC具有半衰期長、作用強的特點。一些分子量較大的肽或蛋白均可利用此法分離分析。
1．1．4離子交換色譜（Iron-Exchange chromatography,IEXC）
IEXC可在中性條件下，利用多肽的帶電性不同分離純化具有生物活性的多肽。其可分為陽離子柱與陰離子柱兩大類，還有一些新型樹脂，如大孔型樹脂、均孔型樹脂、離子交換纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠樹脂等。在多肽類物質的分離分析研究中，對多肽的性質、洗脫劑、洗脫條件的研究較多，不同的多肽分離條件有所不同，特別是洗脫劑的離子強度、鹽濃度等對純化影響較大。Wu等報道利用離子交換柱層析法，探討分離牛碳酸酐異構體和牛血清白蛋白、雞血清白蛋白酶的提取條件，獲得了有價值的數據供今後此類物質分離研究。
1．1．5膜蛋白色譜（Chromatography of Membrane Protein,CMP）
CMP+分離強蔬水性蛋白、多肽混合物的層析系統，一般有去垢劑（如SDS）溶解膜蛋白後形成SDS-融膜蛋白，並由羥基磷灰石為固定相的柱子分離純化。羥基磷灰石柱具有陰離子磷酸基團（P-端），又具有陽離子鈣（C-端），與固定相結合主要決定於膜蛋白的大小、SDS結合量有關。利用原子散射法研究cAMP的分離機制發現，樣品與SDS結合後在離子交換柱上存在SDS分子、帶電荷氨基酸與固定相中帶電離子間的交換，從而達到分級分離的目的。
1．1．6高效置換色譜（High-Performance Displacement Chromatography,HPDC）
HPDC是利用小分子高效置換劑來交換色譜柱上的樣品，從而達到分離的目的。它具有分離組分含量較少成分的特性。利用HPDC鑒定分離了低於總量1%組分的活性人重組生長激素（rHG ）。在研究非毒性交換劑時Jayarama發現硫酸化葡萄糖（Detran Sulfate，DS）是對β乳球蛋白A和B的良好置換劑，一般DS的相對分子質量為1×104和4×104最宜。研究表明置換劑的相對分子質量越低，越易於與固定相結合，因此在分離相對分子質量小的多肽時，需要更小的置換劑才能將其置換純化出來。
1.1.7 灌注層析（Perfusion Chromatography，PC）
PC是一種基於分子篩原理與高速流動的流動相的層析分離方法，固定相孔徑大小及流動相速度直接影響分離效果。試驗證明其在生產、制備過程中具有低投入、高產出的特性。目前市場上可供應的PC固定相種類較多，適合於不同分子量的多肽分離使用。
1.2 親和層析（Affinity Chromatography，AC）
AC是利用連接在固定相基質上的配基與可以和其特異性產生作用的配體之間的特異親和性而分離物質的層析方法。自1968年Cuatrecasas提出親和層析概念以來，在尋找特異親和作用物質上發現了許多組合，如抗原-抗體、酶-催化底物、凝集素-多糖、寡核苷酸與其互補鏈等等。對多肽類物質分離目前主要應用其單抗或生物模擬配基與其親和，這些配基由天然的，也有根據其結構人工合成的。Patel等人利用一系列親和柱分離純化到了組織血漿纖維蛋白酶原激活劑蛋白多肽。
固定金屬親和層析（Immobilized Metal Affinity Chromatography.LMAC）是近年來發展起來的一種親和方法。其固定相基質上鰲合了一些金屬離子，如Cu2+、Ni2+、Fe3+等，此柱可通過配為鍵鰲合側鏈含有Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和His的多肽，特別是肽序列中含有His-X-X-X-His的結構最易結合到金屬離子親和柱上，純化效果較好。其中胰島素樣生長因子（Insylin Like Growth Factor，IGF）、二氫葉還原酶融合蛋白等均用此方法分離到純度較高的產品。
Chaiken等人報道了另一種親和層析方法，利用反義DNA表達產生，其與正鏈DNA表達產生的肽或蛋白具有一定的親和性，如Arg加壓素受體復合物，已用此法分離得到。DNA與蛋白、多肽復合物之間的作用也是生物親和中常用的方法。將人工合成的寡核苷酸結合在固定相基質上，將樣品蛋白或多肽從柱中流過，與之結合可達到分離特定結構多肽的目的。
1.3 毛細管電泳（Capillary electrophoresis，CE）--分離分析方法
CE是在傳統的電泳技術基礎上於本世紀60年代末由Hjerten發明的，其利用小的毛細管代替傳統的大電泳槽，使電泳效率提高了幾十倍。此技術從80年代以來發展迅速，是生物化學分析工作者與生化學家分離、定性多肽與蛋白類物質的有利工具。CE根據應用原理不同可分為以下幾種；毛細管區帶電泳Capillary Zone electrophoresis，CZE）、毛細管等電聚焦電泳（Capillary Isoeletric Focusing，CIEF）毛細管凝膠電泳（CapillaryGelElectrophoresis，CGE）和膠束電動毛細管層析（Micellar Electokinetic Electrophoresis Chromatorgraphy,MECC）等。
1.3.1 毛細管區帶電泳（Capillary Zone Electrophoresis，CZE）
CZE分離多肽類物質主要是依據不同組分中的化合物所帶電性決定，比傳統凝膠電泳更准確。目前存在於CZE分離分析多肽物質的主要問題是天然蛋白或肽易與毛細管硅膠柱上的硅醇發生反應，影響峰形與電泳時間，針對這些問題不少學者做了大量實驗進行改進，如調節電池泳液的PH值，使與硅醇反應的極性基團減少；改進毛細管柱材料的組成，針對多肽性質的不同採取不同的CZE方法研究分離5個含9個氨基酸殘基的小肽，確定了小肽分析的基本條件，即在低PH條件下，緩沖液中含有一定濃度的金屬離子如Zn2+等，此時分離速度快而且准確。
1．3．2細管等電聚電泳（Capillary Isleletric Focusing,CIEF）
由於不同的蛋白、多肽的等電點（PI）不同，因此在具有不同pH梯度的電泳槽中，其可在等電點pH條件下聚集沉澱下來，而與其他肽類分離開來。CIEF在分離、分析混合多肽物質中應用不多，主要應用與不同來源的多肽異構體之間的分離，如對rHG不同異構體分離。由於在CIEF柱表面覆蓋物的不穩定性限制了此法的廣泛應用。
1．3. 3毛細管凝膠電泳 (Capillary Gel Electrophoresis,CGE)
CGE是基於分子篩原理，經十二烷基磺酸鈉（SDS）處理的蛋白或多肽在電泳過程中主要靠分子形狀、分子量不同而分離。目前，又有一種非交聯歡、線性、疏水多聚凝膠柱被用於多肽物質的分離分析，此電泳法適於含疏水側鏈較多的肽分離，這種凝膠易於灌注，使用壽命長，性質較為穩定。
1．3．4膠束電動毛細管層析（Micellar Electrokinetic Electorphoresis Chromatography, MECC）
MECC的原理是在電泳液中加入表面活性劑，如SDS，使一些中性分子帶相同電荷分子得以分離。特別對一些小分子肽，陰離子、陽離子表面活性劑的應用都可使之形成帶有一定電荷的膠束，從而得到很好的分離效果。有文獻報道在電解液中加入環糊精等物質，可使用權含疏水結構組分的多肽選擇性與環糊精的環孔作用，從而利用疏水作用使多肽得到分離。
1．4多肽蛋白質分離工程的系統應用
以上提到的分離多肽的技術在實際應用過程中多相互結合，根據分離多肽性質的不同，採用不同的分離手段。特別是後基因組時代，對於蛋白質組深入的研究，人們對於分離多肽及蛋白質的手段不斷改進，綜合利用了蛋白質和多肽的各種性質，採用包括前面提到的常規蛋白多肽提取方法，同時利用了高效液相色譜，毛細管電泳，2-D電泳等手段分離得到細胞或組織中盡可能多的蛋白多肽。在蛋白質組學研究中系統應用蛋白和多肽分離鑒定的技術在此研究中即是分離手段也是分析方法之一。特別是以下提到的質譜技術的發展，大大的提高了蛋白多肽類物質的分析鑒定的效率。
2 分析方法
2．1 質譜分析（Mass Spectrometry, MS）
MS在蛋白、多肽分析中已經得到了廣泛應用，特別是在分離純化後的在線分析中，MS的高敏性、快速性特別適合多肽物質分析鑒定。其中連續流快原子轟擊質譜（Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB）和電霧離子化質譜（Electrospray Ionization, EIS）是近幾年發展起來的新方法。
2．1．1連續流快原子轟擊質譜（Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB）
cf-FAB是一種弱離子化技術，可將肽類或小分子量蛋白離子化成MH+或（M-H）形式。主要應用於肽類的分離檢測，其具有中等解析度，精確度大於+0.2amu，流速一般在0.5-1.5μl·Ml-1。在測定使流動相需加0.5%-10%基質如甘油和高有機溶劑成分，使樣品在檢測探針處達到敏感化。cf-FAB常與HPLC、CEZ等方法結合使用達分離分析的目的，許多多肽的cf-FAB分析方法已經建立，並得到很好的應用。如Hideaki等利用此法研究L-Pro、L-Ala的四肽化合物系列。證明L-Pro在保持小肽構相穩定性。連接分子方面具有重要意義。
2.1.2 電霧離子化質譜（Electrospray Ionozation，EIS）
EIS可產生多價離子化的蛋白或多肽，允許相對分子質量達1×105蛋白進行分析，解析度在1500-2000amu。精確度在0.01%左右。EIS更適合相對分子質量大的蛋白質的在線分析，且需要氣化或有機溶劑使樣品敏感化。利用EIS與HPLC聯合分離分析GH和血紅蛋白均獲成功，其也可與CEZ聯合應用。
2.1.3 基質輔助激光解析/離子化-飛行時間質譜（Matrix-associated laser disso-ciation/ionization time of flight mass spectrmtry，MALDI-TOF MS）
MALDI-TOF是目前蛋白質鑒定中精確測定測定分子質量的手段，特別適合對混合蛋白多肽類物質的相對分子質量的測定，靈敏度和解析度均較高。它是目前蛋白質組學研究的必備工具。同時結合液相色譜的聯用技術可以高效率的鑒定多肽物質。特別是當各種原理的質譜技術串聯應用時，不但可以得到多肽的相對分子質量信息，還可以測定它的序列結構，此項技術將在未來蛋白質組學研究中起到決定性作用。
2.2 核磁共振(Nuclear Magnetic resonance，NMR)
NMR因圖譜信號的純數字化、過度的重疊范圍過寬（由於相對分子質量太大）核信號弱等原因，在蛋白、多肽物質的分析中應用一直不多。隨著二維、三維以及四維NMR的應用，分子生物學、計算機處理技術的發展，使NMR逐漸成為此類物質分析的主要方法之一。NMR可用於確定氨基酸序列、定量混合物中的各組分組成含量等分析中。但要應用於蛋白質分析中仍有許多問題需要解決，例如，如何使分子量大的蛋白質有特定的形狀而便於定量與定性分析，如何減少數據處理的時間問題等。這些問題多有不少學者在進行研究。雖然在蛋白質分析中應用較少，NMR在分析分子中含少於30個氨基酸的小肽時是非常有用的，可以克服上述蛋白質分析中的缺點而達到快速准確分析的目的。
2.3 其他
除上述方法之外，氨基酸組成分析、氨基酸序列分析、場解析質譜、IR、UV光譜、CD、圓而色譜、生物鑒定法、放射性同位素標記法及免疫學方法等都已應用於多肽類物質的結果鑒定、分析檢測之中。
以上簡要的介紹了近幾年多肽物質分離、分析的常用方法及最新研究方向。隨著科學技術水平的不斷發展，會有許多更新的分離分析手段不斷涌現，因此這一領域的研究具有廣闊的前景。
應用SDS-PAGE顯示小分子多肽
SDS-PAGE在分離、鑒定和純化蛋白質方面有著廣泛應用，其有效分離范圍取決於聚丙烯醯胺的濃度和交聯度，其孔徑隨著雙丙烯醯胺與丙烯醯胺比率的增加而減小，比率接近於1：20時，孔徑達到最小值。分子量低於10kD的小分子肽類，即使用較高濃度的聚丙烯醯胺凝膠的SDS-PAGE也不能完全分離，或是顯不出色，或是顯帶較弱，帶型彌散。且分子量越小，效果也越差。
為了能在SDS-PAGE上顯示測定小分子量的多肽，通常採取兩種方法：一是增加凝膠的濃度和交聯度，在制膠時加入一些可以降低聚丙烯醯胺凝膠網限孔徑的溶質分子，使用尿素、甘油或蔗糖等物質；二是選擇緩沖液中的拖尾離子的種類和濃度以達到改善多肽的分離效果。
操作步驟
1．電泳緩沖液的配製如下表所示
緩沖液Tris
(mol/L)Tricine
(mol/L)pHSDS
(%)
陽極緩沖液
陰極緩沖液
膠緩沖液0.2
0.1
3.0—
0.1
—8.9*
8.25**
8.4*—
0.1
0.3
* 用HCl調pH
** pH約為8.25
2．丙烯醯胺貯存液的配製
單丙-雙丙混合物單丙的百分數雙丙的百分數
49.5% T, 3%C
49.5% T, 6%C48
46.51.5
3.0
T：丙烯醯胺的總濃度
C：交聯度
3．膠的制備，與一般SDS-PAGE相似，按下表配製分離膠和濃縮膠
組 份分離膠
16% T，6%C濃縮膠
6% T，3%C
49.5% T, 3%C丙烯醯胺溶液（ml）
49.5% T, 6%C 丙烯醯胺溶液（ml）
膠緩沖液（ml）
脲（g）[甘油（ml）]
水（ml）
10%過硫酸銨（μl）
TEMED（μl）
總體積（ml）—
3.3
3.3
3.6[2.4]
1
40
4.0
10.040.48
—
1.00
—
1.50
25
2.5
3.03
4．樣品緩沖液
4% SDS
12%甘油
50mmol/L Tris
2%巰基乙醇
0.01% Serva blue
多肽樣品與樣品緩沖液混合沸煮2min（或40℃溫浴30min）。
5．將灌膠的玻璃板固定在電泳裝置上，用1%瓊脂糖封邊，倒入陰極緩沖液，依次加樣。
6．將電泳裝置放入電泳槽內，倒入陽極緩沖液，將正負極與電泳儀相接，恆電壓50~60V，待指示劑進入分離膠後，電壓可升至70~90V，恆壓約3h待指示劑走出凝膠下緣停止電泳。
7．染色、脫色及膠的保存同SDS-PAGE
⑽ 膜蛋白質的從基因序列分析其分子量為4000,但是根據離心沉降方法計其分子量為8000，說明了什麼
分離蛋白質混合物的各種方法主要是根據蛋白質在溶液中的以下性質：1）分子大小；）溶解度；3）電荷；4）吸附性質；5）對其它分子的生物學親和力等進行分離.常見的分離提純蛋白質的方法有：1、鹽析與有機溶劑沉澱：在蛋白質溶液中加入大量中性鹽,以破壞蛋白質的膠體性質,使蛋白質從溶液中沉澱析出,稱為鹽析.常用的中性鹽有：硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等.鹽析時,溶液的pH在蛋白質的等電點處效果最好.凡能與水以任意比例混合的有機溶劑,如乙醇、甲醇、丙酮等,均可引起蛋白質沉澱.2、電泳法：蛋白質分子在高於或低於其pI的溶液中帶凈的負或正電荷,因此在電場中可以移動.電泳遷移率的大小主要取決於蛋白質分子所帶電荷量以及分子大小.3、透析法：利用透析袋膜的超濾性質,可將大分子物質與小分子物質分離開.4、層析法：利用混合物中各組分理化性質的差異,在相互接觸的兩相（固定相與流動相）之間的分布不同而進行分離.主要有離子交換層析,凝膠層析,吸附層析及親和層析等,其中凝膠層析可用於測定蛋白質的分子量.5、分子篩：又稱凝膠過濾法,蛋白質溶液加於柱之頂部,任其往下滲漏,小分子蛋白質進入孔內,因而在柱中滯留時間較長,大分子蛋白質不能進入孔內而徑直流出,因此不同大小的蛋白質得以分離.6、超速離心：利用物質密度的不同,經超速離心後,分布於不同的液層而分離.超速離心也可用來測定蛋白質的分子量,蛋白質的分子量與其沉降系數S成正比.