培養基過濾太慢nalgene濾器

㈠ 瓶頂過濾器 可以反復高效沖洗的那種，型號是多少 那裡有賣的

可重復用的瓶頂過濾器Nalgene.DS0320-5045，譽維生物有！！！你在網路搜一下唄

㈡ 用氯化鈣怎樣制備新鮮的大腸桿菌感受態細胞

這屬於專業問題啦 下面的簡單方案是Clhen等(1972)所用方法的變通方案，常用於成批制備感受態細菌，這些細菌可使每微克螺旋質粒DNA產生5x106-2x107 個轉化菌落，這樣的轉化效率足以滿足所有在質粒中進行的常規克隆的需要。該方法完全適用於大多數大腸桿菌菌株，並且比方案I快速，重復性更好。該法制備的感受態細胞可貯存於-70℃，但保存時間過長會使轉化效率在一定程度上受到影響。 1、從於37℃培養16-20小時的新鮮平板中挑取一個單菌落(直徑2-3mm)，轉到一個含有100ml LB或SOB培養基的1L燒瓶中。於37℃劇烈振搖培養約3小時(旋轉搖床，300轉/分)。為得到有效轉化，活細胞數不應超過108細胞/ml，可每隔 20-30分種測量OD600值來監測培養物的生長情況。在菌株與菌株之間，OD600值和每毫升中活細胞數間的關系變化很大，因此有必要通過測量特定大腸桿菌菌株的生長增減物在生長周期的不同時相的OD600值，並將各濃度的增減物鋪於無抗生素的LB瓊脂平皿以計算每一時相的活細胞數，從而使分光光度讀數得到標化。 2、在無菌條件下將細菌轉移到一個無菌、一次性使用的、用冰預冷的50ml聚丙烯管(Falcon 2070)中，在冰上放置10分鍾，使培養物冷卻至0℃。切記：下述所有步驟均需無菌操作。 3、於4℃用Sorvall GS3轉頭(或與其相當的轉頭)以4000轉/分離心10分鍾，以回收細胞。 4、倒出培養液，將管倒置1分鍾以使最後殘留的痕量培養液流盡。 5、以10ml用冰預冷的0.1mol/L CaCl2重懸每份沉澱，放置於冰浴上。我們發現將1mol/L CaCl2貯存液用純水(Mille-Q級或與其相當的級別)配製以10ml小份貯存於-20℃煞是方便。制備感受態細胞時，取一小份融化，用純水稀釋至100ml，用Nalgene濾器(0.45μm孔徑)過濾除菌，然後驟冷到0℃即可。對於大多數大腸肝菌菌株(除MC1061外)，在這一步採用TFB代替氯化鈣可得到相同的或更好的結果。 6、於4℃以4000轉/分離心10分鍾，以回收細胞。 7、倒出培養液，將管倒置1分鍾以使最後殘留的痕量培養液流盡。 8、每50ml初始培養物用2ml用冰預冷的0.1mol/L CaCl2[或TFB，見步驟5，注]重懸每份細胞沉澱。此時，可將細胞分成小份，放於-70℃凍存。在這些條件下，盡管長期保存後轉化效率會稍有下降，但細胞仍可保持處於感受態。Dagert和Ehrlich(1979)曾表明細胞可以於4℃在CaCl2溶液中保存24-48小時，在貯存的最初12-24小時內，轉化效率增加3-5倍，然後降低到初始水平。 9、用冷卻的無菌吸頭從每種感受態細胞懸液中各取200μl轉移到無菌的微量離心管中，每管加DNA(體積∞10μl，DNA∞50ng)，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30分鍾。 10、將管放到預加溫到42℃的循環水浴中放好的試管回上，恰恰放置90秒，不要搖動試管。 11、快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1-2分鍾。 12、每管加800μl SOC培養基。用水溶將培養基加溫至37℃，然後將管轉移到37℃搖床上，溫育45分鍾細菌復甦，並且表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因。如果要求更高的轉化效率，在復甦期中，應溫和地搖動細胞(轉速不超過225轉/分)。 13、將適當體積(每個90mm平板可達200μl)已轉化的感受態細胞轉移到含20mmol/L MgSO4和相應抗生素的SOB瓊脂培養基上。如培養物體積太小(〈10μl)。可再加肉湯培養基，用一無菌的彎頭玻棒輕輕地將轉化的細胞塗到瓊脂平板表面。如在一個90mm平板上鋪200μl以上的感受態細胞，應離心濃縮細胞，然後用適量SOC輕輕重懸細胞。如用四環素抗性作為選擇標記，全部的轉化混合物可以鋪在一個單獨的平皿上(或鋪在軟瓊脂中)。然而如選用氨苄青黴素抗性，則只能將一部分培養物(根據實驗決定)鋪在單獨的平皿上。氨苄青黴素抗性功的增加與平皿上所加細菌數的增加並無線性比例關系，這可能是因為被抗生素殺死的細胞可釋放生長掏物質的緣故。 14、將平板置於室溫直至液體被吸收。 15、倒置平皿，於37℃培養，12-16小時後可出現菌落。如檢查氨苄青黴素抗性，用轉化細胞鋪增板時密度較低(每個90mm平板不超過104菌落)，於37℃培養平板時不應超過20小時。氨苄青黴素抗性的轉化可將β-內醯胺酶分泌到培養基中，迅速滅活菌落周圍區域中的抗生素。這樣，鋪平板時密度太高或培養時間太長都會導致出現對氨苄青黴素敏感的衛星菌落。在選擇培養基中不用氨苄青黴素而改用羧苄青黴素，以及將抗生素濃度從60μg/ml增至100μg/ml，可使情況有所改善，但不能徹底根除之。

㈢ 用氯化鈣怎樣制備新鮮的大腸桿菌感受態細胞

這屬於專業問題啦 下面的簡單方案是等(1972)所用方法的變通方案，常用於成批制備感受態細菌，這些細菌可使每微克螺旋質粒DNA產生5x106-2x107 個轉化菌落，這樣的轉化效率足以滿足所有在質粒中進行的常規克隆的需要。該方法完全適用於大多數大腸桿菌菌株，並且比方案I快速，重復性更好。該法制備的感受態細胞可貯存於-70℃，但保存時間過長會使轉化效率在一定程度上受到影響。 1、從於37℃培養16-20小時的新鮮平板中挑取一個單菌落(直徑2-3mm)，轉到一個含有100ml LB或SOB培養基的1L燒瓶中。於37℃劇烈振搖培養約3小時(旋轉搖床，300轉/分)。為得到有效轉化，活細胞數不應超過108細胞/ml，可每隔 20-30分種測量OD600值來監測培養物的生長情況。在菌株與菌株之間，OD600值和每毫升中活細胞數間的關系變化很大，因此有必要通過測量特定大腸桿菌菌株的生長增減物在生長周期的不同時相的OD600值，並將各濃度的增減物鋪於無抗生素的LB瓊脂平皿以計算每一時相的活細胞數，從而使分光光度讀數得到標化。 2、在無菌條件下將細菌轉移到一個無菌、一次性使用的、用冰預冷的50ml聚丙烯管(Falcon 2070)中，在冰上放置10分鍾，使培養物冷卻至0℃。切記：下述所有步驟均需無菌操作。 3、於4℃用Sorvall GS3轉頭(或與其相當的轉頭)以4000轉/分離心10分鍾，以回收細胞。 4、倒出培養液，將管倒置1分鍾以使最後殘留的痕量培養液流盡。 5、以10ml用冰預冷的0.1mol/L CaCl2重懸每份沉澱，放置於冰浴上。我們發現將1mol/L CaCl2貯存液用純水(Mille-Q級或與其相當的級別)配製以10ml小份貯存於-20℃煞是方便。制備感受態細胞時，取一小份融化，用純水稀釋至100ml，用Nalgene濾器(0.45μm孔徑)過濾除菌，然後驟冷到0℃即可。對於大多數大腸肝菌菌株(除MC1061外)，在這一步採用TFB代替氯化鈣可得到相同的或更好的結果。 6、於4℃以4000轉/分離心10分鍾，以回收細胞。 7、倒出培養液，將管倒置1分鍾以使最後殘留的痕量培養液流盡。 8、每50ml初始培養物用2ml用冰預冷的0.1mol/L CaCl2[或TFB，見步驟5，注]重懸每份細胞沉澱。此時，可將細胞分成小份，放於-70℃凍存。在這些條件下，盡管長期保存後轉化效率會稍有下降，但細胞仍可保持處於感受態。Dagert和Ehrlich(1979)曾表明細胞可以於4℃在CaCl2溶液中保存24-48小時，在貯存的最初12-24小時內，轉化效率增加3-5倍，然後降低到初始水平。 9、用冷卻的無菌吸頭從每種感受態細胞懸液中各取200μl轉移到無菌的微量離心管中，每管加DNA(體積∞10μl，DNA∞50ng)，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30分鍾。 10、將管放到預加溫到42℃的循環水浴中放好的試管回上，恰恰放置90秒，不要搖動試管。 11、快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1-2分鍾。 12、每管加800μl SOC培養基。用水溶將培養基加溫至37℃，然後將管轉移到37℃搖床上，溫育45分鍾細菌復甦，並且表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因。如果要求更高的轉化效率，在復甦期中，應溫和地搖動細胞(轉速不超過225轉/分)。 13、將適當體積(每個90mm平板可達200μl)已轉化的感受態細胞轉移到含20mmol/L MgSO4和相應抗生素的SOB瓊脂培養基上。如培養物體積太小(〈10μl)。可再加肉湯培養基，用一無菌的彎頭玻棒輕輕地將轉化的細胞塗到瓊脂平板表面。如在一個90mm平板上鋪200μl以上的感受態細胞，應離心濃縮細胞，然後用適量SOC輕輕重懸細胞。如用四環素抗性作為選擇標記，全部的轉化混合物可以鋪在一個單獨的平皿上(或鋪在軟瓊脂中)。然而如選用氨苄青黴素抗性，則只能將一部分培養物(根據實驗決定)鋪在單獨的平皿上。氨苄青黴素抗性功的增加與平皿上所加細菌數的增加並無線性比例關系，這可能是因為被抗生素殺死的細胞可釋放生長掏物質的緣故。 14、將平板置於室溫直至液體被吸收。 15、倒置平皿，於37℃培養，12-16小時後可出現菌落。如檢查氨苄青黴素抗性，用轉化細胞鋪增板時密度較低(每個90mm平板不超過104菌落)，於37℃培養平板時不應超過20小時。氨苄青黴素抗性的轉化可將β-內醯胺酶分泌到培養基中，迅速滅活菌落周圍區域中的抗生素。這樣，鋪平板時密度太高或培養時間太長都會導致出現對氨苄青黴素敏感的衛星菌落。在選擇培養基中不用氨苄青黴素而改用羧苄青黴素，以及將抗生素濃度從60μg/ml增至100μg/ml，可使情況有所改善，但不能徹底根除之。

㈣ 過濾器是由哪些物質組成的

過濾滅菌：一些抄生長因子、襲氨基酸、維生素和一些毒素是熱不穩定的，在高溫、高壓滅菌過程中會被破壞。

這些物質的消毒應該採用濾網或是利用0.450.22μm孔徑的濾膜過濾滅菌。在過濾滅菌的過程中，所有那些大於過濾器孔徑的顆粒、微生物和病毒可以被過濾掉。

大部分的過濾器由纖維素乙酸酯和或纖維素硝酸酯構成，這些一次性使用的塑料過濾器銷售前已預滅菌。一系列細菌不能透過的濾膜（Millipore、Nalgene、Sartorius等公司生產的）及相關儀器可以被用於對體積為1200mL的液體的滅菌。

當一種不耐熱的物質X需要加到培養基中時，常用過濾滅菌。具體的操作方法為：將不含有X物質的培養基加入到三角瓶中，首先在高壓滅菌器中滅菌，當培養基仍然為液體狀態時（約50攝氏度），用裝配有濾膜的皮下注射器將物質X注射到培養基中。攪拌均勻後分配到已滅菌的培養容器中，這些操作要在超凈工作台或層流凈化罩中進行。若需滅菌的物質體積較大，則要用真空過濾器進行過濾。