陽離子交換層析的實驗步驟

『壹』 求離子交換色譜法分離蛋白質試驗步驟

離線來pH梯度-強陽離子交換色譜法分離源肽段混合物 這篇文獻能否幫助您？
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『貳』 以離子交換色譜法為例，簡述濕法裝柱的操作過程和注意事項

1.樣品處理：對被分離樣品有時要經過水解等化學處理，樣品溶液一般要兼顧到濃度與粘度兩方面。
+ B4 ^: J i3 _) \- T: R/ |" v2.離子交換柱的安裝：層析柱內徑必須粗細均勻，柱管大小可據實際需要選擇。柱下端膠塞中插入一放液管，膠塞上蓋以園形尼龍綢或發泡塑料片以防止交換樹脂流出。
+ H/ ?0 X, d' E2 P8 h& S- U3.裝柱：⑴裝柱質量是確保柱層析分離效果的技術關鍵之一，越是高技術層析(如使用毛細管層析柱的高級層析設備)裝柱的技術要求和難度越高，以至手工操作很難達到。⑵裝柱的質量要求，無論是手工、機械、自動化裝柱都是一樣的，要求裝入柱中的分離載體材料松緊適度，分布均勻，無氣泡、無斷層、無結節，能保持正常的溶脹形態和結構；⑶裝入柱中樹脂的高度與直徑之比因分離對象和分離目的不同而相差很大，本教材推薦的肝素鈉洗脫柱裝柱高度是柱徑的4～6倍。⑷操作次序，以手工裝入溶脹的D254樹脂（濕法裝柱）為例，其操作程序可概括為：①查連接(柱與塞之間、上下塞與進出液管之間、梯度混合器與進液管之間、出液管與收集器之間等等的連接是否正確、緊密)，②試止漏（塞子、接頭、活塞開關處在長時間滿負荷下不泄漏），③加隔離緩沖墊（緊貼於柱子下端塞子的內平面），④加少許平衡液於空柱內，⑤趕氣泡（緩沖墊內和出水管中的氣泡），⑥開通放水開關，⑦與放水量保持相當的流速，向柱內勻速加完載體材料漿，⑧關閉放水開關，令樹脂自然下沉，⑨用洗滌液和清水洗滌樹脂，⑩最後用緩沖液過柱和平衡柱，使樹脂結構平衡穩定，⑾在樹脂表面蓋上一片尼龍或泡膜塑料，並與柱子內壁保持嚴密接觸，以防加樣時樹脂泛起。
( ?6 Y, g6 D5 S2 e- z% v b* m4.加樣：緩緩打開柱子下端的放液開關,使柱內液面剛好降至樹脂面時便立即將樣品溶液小心地加到尼龍或泡膜塑料片上，待樣品液面剛好進入樹脂層內便立即加入少許平衡緩沖液,以清洗粘附在覆蓋層中的樣品，並隨之進入樹脂層。當柱內液位接近樹脂表面時便立即添加洗滌液進行洗滌操作。$ o+ c9 M: n3 `% Q
5.洗滌：選用合適的洗滌液、恰當的總用量及洗滌流速，小心洗滌柱內樹脂，以除去不被離交樹脂吸附的雜質。: K0 s* j/ p; W4 d) o7 W6 _
6.洗脫：由洗脫曲線找出洗脫液的最佳濃度和適當的總量、操作壓及流速進行洗脫。
5 m- U F# X! m' M. O# g! |7.監測：用敏感快速的方法（參見下文「測定」）監測分離成分是否洗脫出來以及洗脫峰的軸向分布
9 v2 C$ h- _- \: S8.收集：一旦發現待分離成分洗脫出來便可進行一步或分步收集，並可根據各成分洗脫峰的軸向分布和濃度監測，決定產品收集濃度區段，棄去的洗脫液可循環用於相同成分的洗脫。
1 v7 I2 v8 H, m8 y3 ] M; J8 m9.沉澱/離心：用沉澱劑可將分離組分沉澱或離心下來脫水乾燥，沉澱劑回收再用。
" a3 @7 z0 a' t10.脫水乾燥：加入適當脫水劑為如無水乙醇、丙酮或乙醚脫水後進一步乾燥。5 _" H" J" X0 e% v" V
11.測定：對層析所得產品可稱重或測定活性計算其得量和收率。. ^7 ]4 x, e- `1 p# y- z. d7 g9 m5 `
【注意事項】4 G; U! }* `$ X7 C" b: b0 f
1.應根據被分離物質的理化性質、分子大小、分子形狀和分離的目的要求，選擇分離效果好、交換容量大而機械強度較高的分離載體材料。市售的分離載體有明確的規格型號、理化性質、功能作用、活化再生和保養存放等技術參數資料可供用戶選擇。
* K7 Q, U. T% x8 y5 R2.應根據分離純化的對象、規模選擇層析柱的長短、粗細、柱高與內徑之比，使達到最佳分離效果；此外，柱子材料的化學性質要穩定、透明，內徑要均一、光滑，死腔要愈小愈好，要有利於緊固、連接、裝柱與維護。
4 E& F! k7 Q. W3 [& s/ k( ?- P3.柱子安放要垂直、穩固，與之相連的各種線路、管道、設備、設施的布局和連接要緊奏，要方便操作、觀察與維護。4 F5 w( v8 w+ c4 C
4.要求裝入柱中的分離載體材料松緊適度，分布均勻，無氣泡、無斷層、無結節，能保持正常的溶脹形態和結構。5 F n1 O% }8 d z+ T0 L# t2 |3 C
5.保持柱內樹脂層面平整、層序結構始終如一是確保柱層析分離效果的又一技術關鍵。為此，從裝柱到洗脫結束的過程中，尤其是加樣、洗滌、洗脫過程中要始終保持柱內液位不低於柱內樹脂的頂部平面，尤其要始終保持柱內樹脂的層序結構始終如一，不被打亂，特別要防止更換濃度不同的洗滌洗脫液時發生「翻缸」而攪亂樹脂層結構，「壓缸」而造成柱層斷裂和梗塞斷流。
7 z/ W" C+ E8 q: i& t g6.注意保持一定的操作壓，這對確保層析柱流速和分離效果十分重要。因為流速不僅與洗脫液加在柱上的壓力（因液面差造成）有關，也與裝柱材料的粒度、交聯度、機械強度有關。應針對具體情況建立一個操作壓、流速和分離效果的最佳平衡點。
; N( j K7 n0 T" {9 [$ S6.顯著標明各種洗滌、洗脫液的技術參數，嚴禁亂用和混用。) M) k" o* {2 g( F
7.製作洗脫曲線，確定洗脫液收集方案，設置洗脫監控點。2 N; I* F% \6 e9 I5 J% X1 V
8.注意剔除破損樹脂，及時補足流失、破損的循環樹脂量。
# S5 F F8 K3 V2 ]9 A1 E6 U+ o9.嚴格掌握新、舊樹脂的活化、再生條件，及時再生舊樹脂。$ h4 U9 m: L5 L7 g
樹脂的再生：每次洗脫結束，用清水將樹脂洗出柱體再用、再生，或用高濃度的NaCl溶液浸泡貯存。樹脂經過一段使用後樹脂上的活性基團因被交換而使交換容量大為降低，此時樹脂需要再生處理。( z# |! T+ @) z" O
大處理（酸—鹼—酸）：加入樹脂2倍量的2mol HCL溶液攪拌3小時，自來水沖洗至中性；又用2mol NaOH溶液照酸處理方式處理；再用2mol HCL處理。
5 F% O1 U$ W2 r小處理（鹼—酸）：濃度、方法同上。) o4 @' Y" x8 ]8 s2 {8 P6 i
連續用數次的樹脂進行小處理，用十次後的樹脂要進行大處理。
4 {, T2 J( F& L& C: a- C% E& g$ X9 v10．注意脫水乾燥條件。$ M) H0 {1 @& q' Y9 j" t7 n1 x

『叄』 離子交換層析的具體操作

對於離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉澱的顆粒，以保證有較好的均勻度，對於已溶脹好的產品則不必經這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀鹼處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用「鹼-酸-鹼」處理，使最終轉為-OH-型或鹽型交換劑；對於陽離子交換劑則用「酸-鹼-酸」處理，使最終轉為-H-型交換劑。
洗滌好的纖維素使用前必須平衡至所需的pH和離子強度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時分層，要適當加壓裝柱，同時使柱床壓緊，減少死體積，有利於解析度的提高。
柱子裝好後再用起始緩沖液淋洗，直至達到充分平衡方可使用。 加樣：
層析所用的樣品應與起始緩沖液有相同的pH和離子強度，所選定的pH值應落在交換劑與被結合物有相反電荷的范圍，同時要注意離子強度應低，可用透析、凝膠過濾或稀釋法達此目的。樣品中的不溶物應在透析後或凝膠過濾前，以離心法除去。為了達到滿意的分離效果，上樣量要適當，不要超過柱的負荷能力。柱的負荷能力可用交換容量來推算，通常上樣量為交換劑交換總量的1%-5%。 已結合樣品的離子交換前，可通過改變溶液的pH或改變離子強度的方法將結合物洗脫，也可同時改變pH與離子強度。為了使復雜的組份分離完全，往往需要逐步改變pH或離子強度，其中最簡單的方法是階段洗脫法，即分次將不同pH與離子強度的溶液加入，使不同成分逐步洗脫。由於這種洗脫pH與離子強度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時洗脫，純度較差，不適宜精細的分離。最好的洗脫方法是連續梯度洗脫，洗脫裝置見圖16-6.兩個容器放於同一水平上，第一個容器盛有一定pH的緩沖液，第二個容器含有高鹽濃度或不同pH的緩沖液，兩容器連通，第一個容器與柱相連，當溶液由第一容器流入柱時，第二容器中的溶液就會自動來補充，經攪拌與第一容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。第一容器中任何時間的濃度都可用下式進行計算：
C=C2-(C2-C1)(1-V)A2/A1
式中A1、A2分別代表兩容器的截面積：C1、C2分別表示容器中溶液的濃度；V為流出體積對總體積之比。當A1=A2時為線性梯度，當A1>A2時為凹形梯度，A1>A2時為凸形梯度。
洗脫時應滿足以下要求：
①洗脫液體積應足夠大，一般要幾十倍於床體積，從而使分離的各峰不至於太擁擠。
②梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質能被洗脫下來。
③梯度不要上升太快，要恰好使移動的區帶在快到柱末端時達到解吸狀態。目的物的過早解吸，會引起區帶擴散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。
洗脫餾份的分析按一定體積（5-10ml/管）收集的洗脫液可逐管進行測定，得到層析圖譜。依實驗目的的不同，可採用適宜的檢測方法（生物活性測定、免疫學測定等）確定圖譜中目的物的位置，並回收目的物。
離子交換劑的再生與保存離子交換劑可在柱上再生。如離子交換纖維素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有強吸附物則可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物質則可用非離子型去污劑洗柱後再生，也可用乙醇洗滌，其順序為：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20%NaOH-水。保存離子交換劑時要加防腐劑。對陰離子交換劑宜用0.002%氯已定（洗必泰），陽離子交換劑可用乙基硫柳汞（0.005%）。有些產品建議用0.02%疊氮鈉。

『肆』 紙層析實驗的實驗步驟及現象

氨基酸的紙層析 一、 實驗目的 1.了解並掌握氨基酸紙層析的原理和方法。 2.學習紙層析法的操作技術，分析未知樣品氨基酸的成分。 二、 實驗原理 用濾紙為支持物進行層析的方法，稱為紙層析法，它是分配層析法的一種。紙層析所用的展層溶劑大多是由水飽和的有機溶劑組成。濾紙纖維的—OH 基的親水性基團，可吸附有機溶劑中的水作為固定相，有機溶劑作為流動相，它沿濾紙自下向上移動，稱為上行層析；反之，使有機溶劑自上而下移動，稱為下行層析。將樣品點在濾紙上進行展層，樣品中的各種氨基酸即在二相中不斷進行分配，由於它們各自的分配系數不同，故在流動相中移動速率不等，從而使不同的氨基酸得到分離和提純。紙層析法主要是依據混合組分對二相分配系數的差異進行分離，但亦存在著某種程度的吸附作用和離子交換現象。氨基酸經層析在濾紙上形成距原點不等的層析點，氨基酸在濾紙上的移動速率用Rf 表示。 Rf = 原點到層析斑點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離 只要實驗條件(如溫度、展層溶劑的組分、pH、濾紙的質量等)不變，Rf 值是常數，因此可做定性分析參考。如果溶質中氨基酸組分較多或其中某些組分的Rf 值相同或近似，用單向層析不宜將它們分開，為此可進行雙向層析，在第一溶劑展開後將濾紙轉動90度，以第一次展層所得的層析點為原點，再用另一種溶劑展層，即可達到分離目的。由於氨基酸無色，可利用茚三酮反應使氨基酸層析點顯色，從而定性和定量。 三、儀器和試劑 儀器 層析濾紙、燒杯、剪刀、層析缸、培養皿、猴頭噴霧器、微量加樣器或毛細管、吹風機一個、直 尺、鉛筆等。 試劑 1.混合氨基酸溶液(水解後的氨基酸乾粉) 甘氨酸溶液：50mg 甘氨酸溶於5mL 水中。 蛋氨酸溶液：25mg 蛋氨酸溶於5mL 水中。 亮氨酸溶液：25mg 亮氨酸溶於5mL 水中。 氨基酸混合液： 甘氨酸50mg，亮氨酸25mg，蛋氨酸25mg 共溶於5mL 水中。 2.展層溶劑 鹼相溶劑：正丁醇∶12%氨水∶95%乙醇 = 13∶13∶13(V/V) 酸相溶劑：正丁醇∶80%甲酸∶水 = 15∶3∶2(V/V)，搖勻後放置半天以上，取上清液備用。 3.顯色貯備液： 0.4mol/L 茚三酮—異丙醇∶甲酸∶水=20∶1∶5。 4.0.1%硫酸銅：75%乙醇=2∶38，臨用前按比例混合。 四、實驗步驟 (1)標准氨基酸單向上行層析法 1.畫基線 戴上指套或橡皮手套，在長約20cm、寬約17cm 濾紙上，距短邊2.5cm 處，用鉛筆畫一條線，即為基線。 2.點樣 在原線上，從距紙的長邊4cm處開始，每隔3cm 用微量注射器或毛細管依次分別點上甘氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和混合氨基酸溶液。點樣點干後可重復點加1～2次。每一點的直徑不超過2mm，點樣量以每種氨基酸含5～20ug 為宜。 3.展層 將點好樣的濾紙捲成筒形，濾紙兩邊不相接觸，用線固定好，將原線的下端浸入盛有溶劑的培養皿中，不需平衡可立即展層。展層劑為酸性溶劑系統，在展層溶劑中加入顯色貯備液(每10mL 展層劑加0.1～0.5mL 的顯色貯備液)進行展層，基線必須保持在液面之上，以免氨基酸與溶劑直接接觸。蓋好層析缸，當溶劑前沿距紙端2cm 時(大約3h)，取出濾紙。 4.顯色 濾紙取出後，吹乾或在80℃左右烘箱內烘3～5min，即出現紫紅色的氨基酸層析 斑點。用鉛筆劃下層析斑點，可進行定性、定量測定。 (2)混合氨基酸雙向上行紙層析法 1.濾紙准備 將濾紙裁成約28cm2的正方形，在距濾紙相鄰兩邊各2cm 處的交點上，用鉛筆劃下一點，做為原點。 2.點樣 取混合氨基酸溶液(5mg/mL)10～15μL，分別點在原點上。 3.展層與顯色 將點好樣的濾紙捲成半筒形，立在培養皿中，原點應在下端。取少量12%的氨水與小燒杯中，蓋好層析缸，平衡過夜。次日，取出氨水，加適量鹼相溶劑(第一向)與培養皿中，蓋好層析缸，上行展層，當溶劑前沿距濾紙上端1～2cm 時，取出濾紙，冷風吹乾。將濾紙轉90o，再捲成半筒形，豎立在干凈培養皿中，並於小燒杯中至少量酸相溶劑，蓋好層析缸，平衡過夜，次日將加顯色劑的酸性溶劑(每10mL 展層劑加0.1～0.5mL 的顯色貯備液)傾入培養皿中，進行第2向展層。展層畢，取出濾紙，用熱風吹乾，藍紫色斑點即顯現。 五、計算 單向層析的Rf 值，按 「Rf = 原點到層析斑點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離」計量後計算。雙向層析Rf 值，由兩個數值組成，在第一向計量一次，第二向計量一次，分別與已知的氨基酸在酸鹼系統的Rf 值對比，即可初步決定它為何種氨基酸的斑點，將它剪下，在同一張紙剪下一塊大小相同的空白紙作為對照，用硫酸銅—乙醇溶液洗脫，用722型分光光度計測定其吸光度，在標准曲線上查出氨基酸的含量。

『伍』 離子交換層析中流出物質順序是什麼

若用離子交換層析分離物質，以蛋白質為例，離子交換層析中，基質是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負電荷的稱之陽離子樹脂。離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化。

由於蛋白質也有等電點，當蛋白質處於不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質，所以這類蛋白質被留在柱子上，然後通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質洗脫下來。結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。

反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質，結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。

(5)陽離子交換層析的實驗步驟擴展閱讀：

對於離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉澱的顆粒，以保證有較好的均勻度，對於已溶脹好的產品則不必經這一步驟。

溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀鹼處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用「鹼-酸-鹼」處理，使最終轉為-OH-型或鹽型交換劑；對於陽離子交換劑則用「酸-鹼-酸」處理，使最終轉為-H-型交換劑。

梯度不要上升太快，要恰好使移動的區帶在快到柱末端時達到解吸狀態。目的物的過早解吸，會引起區帶擴散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。

『陸』 離子交換層析法原理是什麼

離子交換層析法 （ion exchange chromatography，簡稱IEC）是從復雜的混合物中，分離性質相似大分子的方法之一，依據的原理是物質的酸鹼性、極性，也就是所帶陰陽離子的不同。電荷不同的物質，對管柱上的離子交換劑有不同的親和力，改變沖洗液的離子強度和pH值，物質就能依次從層析柱中分離出來。
離子交換層析法大致分為5個步驟：
1. 離子擴散到樹脂表面。
2. 離子通過樹脂擴散到交換位置。
3. 在交換位置進行離子交換；被交換的分子所帶電荷愈多，它與樹脂的結合愈緊密，也就愈不容易被其它離子取代。
4. 被交換的離子擴散到樹脂表面。
5. 沖洗液通過，被交換的離子擴散到外部溶液中。
離子交換樹脂的交換反應是可逆的，遵循化學平衡的規律，定量的混合物通過管柱時，離子不斷被交換，濃度逐漸降低，幾乎全部都能被吸附在樹脂上；在沖洗的過程中，由於連續添加新的交換溶液，所以會朝正反應方向移動，因而可以把樹脂上的離子沖洗下來。
如果被純化的物質是氨基酸類的分子，則分子上的凈電荷取決於氨基酸的等電點和溶液的pH值，所以當溶液的pH 值較低，氨基酸分子帶正電荷，它將結合到強酸性的陽離子交換樹脂上；隨著通過的緩沖液pH逐漸增加，氨基酸將逐漸失去正電荷，結合力減弱，最後被洗下來。由於不同的氨基酸等電點不同，這些氨基酸將依次被洗出，最先被洗出的是酸性氨基酸，如apartic acid和glutamic acid（在約pH3~4時），隨後是中性氨基酸，如glycine和alanine。鹼性氨基酸如arginine和lysine在pH值很高的緩沖液中仍帶有正電荷，因此這些在約pH值高達10~11時才出現。

『柒』 蛋白質水解產物陽離子交換柱層析時的洗脫順序

pI 10.76的那個應該帶正電荷。陽離子交換柱本身帶負電荷。

『捌』 求離子交換柱層析法和擁有分子篩作用的（叫什麼忘了）的兩個實驗報告或操作詳細說明

離子交換層析
Tina 發表於 2006-2-21 12:21:00
材料與儀器

DEAE-32纖維素，pH8.0 0.01 mol/L Tris-HCl，工程菌破碎離心後的上清液；

層析柱

二、 方法與步驟

1） 裝柱：

用水清洗層析柱，柱內留存水距底部約1cm，加入18ml介質（凝膠溶液）。

2） 平衡：

加0.01M,PH8.0,tris-HCl緩沖液，直至流出液PH與緩沖液一致。

3） 上樣：

用量筒量出上清液體積，再加入等體積緩沖液混合，取EP管留1.5ml。待柱中水流出，至剛好覆蓋凝膠表面，靠璧緩慢加樣。

4) 用50ml緩沖液洗滌，用EP管隨機收集樣品穿出液和洗滌穿出液。

5) 洗脫：

將梯度洗滌儀和層析柱連接，洗脫瓶A（混合器）加200µl緩沖液，開口打開至兩瓶液面相平，相通管道出無氣泡，關閉連接，A中加入6gNaCl溶解，把裝置放在梯度混合儀上，開動攪拌器開關，打開A和B的連接通道，層析柱下端連收集器，收集洗脫流出液。

6） 控制流速，約4min/管，2-3ml/管。

分子篩的是凝膠層析
Sephadex G-100凝膠層析
Tina 發表於 2006-2-21 12:27:00
材料與儀器

Sephadex G-100，0.5 mol/L pH8.0 Tris-HCl，濃縮液

層析柱

二、 方法與步驟

1） Sephadex G-100 凝膠預處理

a) 100ml燒杯，稱取5克sephadex G-100,加入50ml去離子水，浸泡溶脹24小時。

b) 傾去sephadex G-100溶脹後凝膠上層的水，加入凝膠等體積的1.0 mol/L NaOH液處理，用攪棒輕輕攪動，並浸泡1小時處理後傾去。用去離子水洗滌。洗滌過程中，用傾去法除去細顆粒。其方法是用攪棒將凝膠攪勻（注意不要過分用力攪拌，以防止顆粒破碎），放置數分鍾，將未沉澱的細顆粒隨上層水倒掉。浮選3-5次，直至上層沒有細顆粒為止，再浸泡水洗至PH中性。

c) 將Sephadex G-100凝膠水溶液盛放於抽濾瓶中，用洗耳球塞住杯口，減壓抽氣30分鍾，除去凝膠溶液內的氣泡，將脫氣後的凝膠溶液輕輕倒入燒杯中，其中盛有1/2去離子水。

2) 裝柱

a) 層析柱(1.0Î50cm)用水清洗干凈，柱的上、下端聯接塑料管接上小乳膠管，裝上螺旋夾。將層析柱垂直裝好。校直過程用下端綁有鑰匙的繩子掛於鐵架的不同位置，從多角度校正使柱垂直。打開柱上埠，從柱底下出口管朝柱內注入水，使柱底全部充滿水而不留氣泡，關閉柱出口。最終柱內留存有2 cm的水。從出口處接上一根直徑2 mm細塑管，塑管另一端固定在柱的上端部位。

b) 攪動凝膠溶液（切勿攪動太快，以免空氣再逸入），使形成均一的薄膠漿，並立即沿玻棒倒入層析管內，讓加入的凝膠在柱內自然沉降，待柱底面上積起約1-2 cm的凝膠床後，打開柱出口水流。隨著柱內水的流出，上面不斷加入凝膠液，使形成的凝膠床面上有凝膠連續下降（如果凝膠床面上不再有凝膠顆粒下降，應該用攪棒均勻地將凝膠床攪起數厘米高，然後再加凝膠，不然就會形成界面，影響層析效果）。

c) 凝膠沉積到柱內凝膠是否均勻，有否「紋路」或氣泡。若層析柱不均一，必須重新裝柱。

3） 平衡

柱裝好後，使層析床穩定15-20分鍾，然後連接洗脫瓶出口和層析柱頂端，用3-5倍體積地緩沖液平衡層析柱。平衡過程中控制上柱緩沖液地進柱操作壓保持恆定。保持流速每滴/10秒。直至流出液的PH與上柱緩沖液完全相同。

4） 樣品洗脫

a) 上樣准備：

i) 上樣前打開層析柱上端，先檢查凝膠床界面是否平整，如果傾斜不平整，可用玻棒將凝膠床界面輕輕攪起後，再使凝膠自然沉降，形成平整狀態的凝膠床界面。用毛細吸管小心吸去大部分清液，然後讓液面自然下降，直至幾乎露出凝膠床界面。

ii) 樣品放入高速離心機，12000r/min、離心5 min。

iii) 上樣前吸取50µl樣品於EP管中，以備走電泳。

b) 樣品上樣：

i) 將樣品由玻棒引流沿管壁加入到凝膠床面上，注意不要將床面凝膠沖起。同時打開層析柱下面流出液開關（控制流速1滴/20秒），保持層析柱下面流出滴速與上樣的滴速一致，控制凝膠床界面不能脫水，並控制樣品區帶盡量狹窄。

ii) 當1.5ml樣品全部加入後，用 1-2 ml的0.5mol/L PH8.0 Tris-HCl洗脫液同上樣時一樣地保持層析柱下面流出滴速與上樣的滴速一致以控制凝膠床界面不能脫水，小心清洗凝膠床界面表面，使黏附著的樣品全部洗入凝膠床。

iii) 然後開始控制上樣的滴速大於層析柱下面流出滴速，使幾乎與凝膠床界面相平的洗脫液液面慢慢提高至凝膠床界面高出2cm左右，封閉層析柱上端。

iv) 保持層析柱上柱洗脫液入口處與層析柱下面流出處有一定勢壓。控制上柱緩沖液的進柱操作壓保持恆定。

c) 洗脫：

用0.1 mol/L PH8.0 Tris-HCl 緩沖液洗脫，用部分收集器收集，4分鍾/管（約2-3ml/管），收集約1-30管。

5） 酶活、酶濃度測定，參見2.6.2，2.6.3

6） 最高酶活收集管洗脫液留50µl，以備走電泳。

7） 將酶活較高的收集液10~14管合並，測定總體積為7.1 ml，精確測定酶活性。並用考馬思亮藍測定蛋白濃度。測酶活時體系稀釋了200倍，定蛋白時無稀釋。

『玖』 離子交換怎麼試驗

離子交換法是一種藉助於離子交換劑上的離子和廢水中的離子進行交換反應而除去廢水中有害離子的方法。離子交換是一種特殊吸附過程，通常是可逆性化學吸附；其特點是吸附水中離子化物質，並進行等電荷的離子交換。
離子交換劑分無機的離子交換劑如天然沸石，人工合成沸石，及有機的離子交換劑如磺化煤和各種離子交換樹脂。
在應用離子交換法進行水處理時，需要根據離子交換樹脂的性能設計離子交換設備，決定交換設備的運行周期和再生處理。通過本實驗希望達到下述目的：
1) 加深對離子交換基本理論的理解；學會離子交換樹脂的鑒別；
2) 學會離子交換設備操作方法；
3) 學會使用手持式鹽度計，掌握pH計、電導率儀的校正及測量方法。
二、實驗內容和原理
由於離子交換樹脂具有交換基因，其中的可游離交換離子能與水中的同性離子進行等當量交換。 用酸性陽離子交換樹脂除去水中陽離子，反應式如下：
nRH + M+n → RnM + nH+
M——陽離子 n——離子價數
R——交換樹脂
用鹼性陰離子交換樹脂除去水中的陰離子，反應式如下：
nROH + Y−n → RnY + nOH-
Y——陰離子
離子交換法是固體吸附的一種特殊形式，因此也可以用解吸法來解吸，進行樹脂再生。
本實驗採用自來水為進水，進行離子交換處理。因為自來水中含有較多量的陰、陽離
子，如Cl¯， NH4+，Ca，Mg，Fe，Al，K，Na等。在某些工農業生產、科研、醫療衛生等工作中所用的水，以及某些廢水深度處理過程中，都需要除去水中的這些離子。而採用離子交換樹脂來達到目的是可行的方法。