Urea配製去離子

1. 植物蛋白肽是怎樣提取的

植物蛋白質提取方法總匯

一、植物組織蛋白質提取方法
1、根據樣品重量（1g樣品加入3.5ml提取液，可根據材料不同適當加入），准備提取液放在冰上。
2、把樣品放在研缽中用液氮研磨，研磨後加入提取液中在冰上靜置（3-4小時）。
3、用離心機離心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃
4、提取上清液，樣品制備完成。
蛋白質提取液：300ml
1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml
2、甘油（Glycerol）75ml
3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g
這種方法針對SDS-PAGE，垂直板電泳！

二、植物組織蛋白質提取方法
氯醋酸—丙酮沉澱法
1、在液氮中研磨葉片
2、加入樣品體積3倍的提取液在-20℃的條件下過夜，然後離心（4℃8000rpm以上1小時）棄上清。
3、加入等體積的冰浴丙酮（含0.07%的β-巰基乙醇），搖勻後離心（4℃8000rpm以上1小時），然後真空乾燥沉澱，備用。
4、上樣前加入裂解液，室溫放置30分鍾，使蛋白充分溶於裂解液中，然後離心（15℃8000rpm以上1小時或更長時間以沒有沉澱為標准），可臨時保存在4℃待用。
5、用Brandford法定量蛋白，然後可分裝放入-80℃備用。
葯品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶於3ml滅菌的去離子水中（終體積為5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。
這種方法針對雙向電泳，雜質少，離子濃度小的特點！當然單向電泳也同樣適用，只是電泳的條帶會減少！

三、組織：腸黏膜
目的：WESTERN BLOT檢測凋亡相關蛋白的表達
應用TRIPURE提取蛋白質步驟：
含蛋白質上清液中加入異丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）
倒轉混勻，置室溫10min
離心：12000 g，10min，4度，棄上清
加入0.3M鹽酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量）
振盪，置室溫20min
離心： 7500g，5 min，4度，棄上清
重復0.3M鹽酸胍/95％乙醇步2次
沉澱中加入100％乙醇 2ml
充分振盪混勻，置室溫20 min
離心： 7500g，5min，4度，棄上清吹乾沉澱
1％SDS溶解沉澱
離心：10000g，10min，4度
取上清-20度保存（或可直接用於WESTERN BLOT）
存在的問題：加入1％SDS後沉澱不溶解，還是很大的一塊，4度離心後又多了白色沉定，SDS結晶？測濃度，含量才1mg/ml左右。
解決：提蛋白試劑盒，另外組織大小適中，要碎，立即加2X BUFFER，然後煮5－10分鍾，效果很好的。

四、植物材料：水稻苗，葉鞘，根
1、200毫克樣品置於冰上磨碎
2、加lysis buffer，離心，10000rpm，4度，5min取上清
3、重復離心5min
lysis buffer：urea np-40 ampholine 2-me pvp-40

五、蛋白質樣品制備
秧苗蛋白質樣品的提取按Davermal等（1986）的方法進行。
100mg材料剪碎後加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配製，含10mM即0.07%β-巰基乙醇），混勻，-20℃沉澱1小時，4℃，15000 r/min離心15 min，棄上清，沉澱復溶於1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巰基乙醇)，再於-20℃沉澱1小時，同上離心棄上清，（有必要再用80％丙酮(含10 mMβ-巰基乙醇所得沉澱低溫冷凍真空抽干。
按每mg乾粉加入20μl（可調） UKS液[9.5 M尿素，5mM碳酸鉀，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫蘇糖醇)，2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10)，6% Triton X-100]，37℃溫育30min，期間攪動幾次，28度 （溫度低，高濃度的尿素會讓溶液結冰）16000 r/min離心15 min，離心力越大時間長一點越好！上清即可上樣電泳。或者-70度保存

六、植物根中蛋白質的抽取
(1) sample, 液氮研磨
(2) 裝1.5 ml centrifuge 用tube
(3) 加 1M KH2PO4 K2HPO4 700 ul
(4) 12000 rpm, 4度, 10-15minite
(5) 取上層液，蛋白質就在裡面

2. 尿素屬於酸性還是鹼性

尿素既不屬於酸性肥料也不屬於鹼性肥料，屬於中性肥料。尿素，又稱碳醯胺，是由碳、氮、氧、氫組成的有機化合物是一種白色晶體。最簡單的有機化合物之一，是哺乳動物和某些魚類體內蛋白質代謝分解的主要含氮終產物。也是目前含氮量最高的氮肥。

作為一種中性肥料，尿素適用於各種土壤和植物。它易保存，使用方便，對土壤的破壞作用小，是目前使用量較大的一種化學氮肥。工業上用氨氣和二氧化碳在一定條件下合成尿素。

(2)Urea配製去離子擴展閱讀

使用注意事項：

1、尿素如果貯存不當，容易吸濕結塊，影響尿素的原有質量，給農民帶來一定的經濟損失，這就要求廣大農戶要正確貯存尿素。在使用前一定要保持尿素包裝袋完好無損，運輸過程中要輕拿輕放，防雨淋，貯存在乾燥、通風良好、溫度在20度以下的地方。

2、如果是大量貯存，下面要用木方墊起20公分左右，上部與房頂要留有50公分以上的空隙，以利於通風散濕，垛與垛之間要留出過道。以利於檢查和通風。已經開袋的尿素如沒用完，一定要及時封好袋口，以利下年使用。

3、避免與皮膚和眼睛接觸。

3. 目前常用的植物蛋白提取方法有哪些

一、植物組織蛋白質提取方法
1、根據樣品重量（1g樣品加入3.5ml提取液,可根據材料不同適當加入）,准備提取液放在冰上.
2、把樣品放在研缽中用液氮研磨,研磨後加入提取液中在冰上靜置（3-4小時）.
3、用離心機離心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃
4、提取上清液,樣品制備完成.
蛋白質提取液：300ml
1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml
2、甘油（Glycerol）75ml
3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g
這種方法針對SDS-PAGE,垂直板電泳!
二、植物組織蛋白質提取方法
氯醋酸—丙酮沉澱法
1、在液氮中研磨葉片
2、加入樣品體積3倍的提取液在-20℃的條件下過夜,然後離心（4℃8000rpm以上1小時）棄上清.
3、加入等體積的冰浴丙酮（含0.07%的β-巰基乙醇）,搖勻後離心（4℃8000rpm以上1小時）,然後真空乾燥沉澱,備用.
4、上樣前加入裂解液,室溫放置30分鍾,使蛋白充分溶於裂解液中,然後離心（15℃8000rpm以上1小時或更長時間以沒有沉澱為標准）,可臨時保存在4℃待用.
5、用Brandford法定量蛋白,然後可分裝放入-80℃備用.
葯品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮.裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶於3ml滅菌的去離子水中（終體積為5ml）,使用前再加入1M的DTT65ul/ml.
這種方法針對雙向電泳,雜質少,離子濃度小的特點!當然單向電泳也同樣適用,只是電泳的條帶會減少!
三、組織：腸黏膜
目的：WESTERN BLOT檢測凋亡相關蛋白的表達
應用TRIPURE提取蛋白質步驟：
含蛋白質上清液中加入異丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）
倒轉混勻,置室溫10min
離心：12000 g,10min,4度,棄上清
加入0.3M鹽酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量）
振盪,置室溫20min
離心：7500g,5 min,4度,棄上清
重復0.3M鹽酸胍/95％乙醇步2次
沉澱中加入100％乙醇 2ml
充分振盪混勻,置室溫20 min
離心：7500g,5min,4度,棄上清吹乾沉澱
1％SDS溶解沉澱
離心：10000g,10min,4度
取上清-20度保存（或可直接用於WESTERN BLOT）
存在的問題：加入1％SDS後沉澱不溶解,還是很大的一塊,4度離心後又多了白色沉定,SDS結晶?測濃度,含量才1mg/ml左右.
解決：提蛋白試劑盒,另外組織大小適中,要碎,立即加2X BUFFER,然後煮5－10分鍾,效果很好的.
四、植物材料：水稻苗,葉鞘,根
1、200毫克樣品置於冰上磨碎
2、加lysis buffer,離心,10000rpm,4度,5min取上清
3、重復離心5min
lysis buffer：urea np-40 ampholine 2-me pvp-40
五、蛋白質樣品制備
秧苗蛋白質樣品的提取按Davermal等（1986）的方法進行.
100mg材料剪碎後加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂,用液氮研磨成粉,加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配製,含10mM即0.07%β-巰基乙醇）,混勻,-20℃沉澱1小時,4℃,15000 r/min離心15 min,棄上清,沉澱復溶於1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巰基乙醇),再於-20℃沉澱1小時,同上離心棄上清,（有必要再用80％丙酮(含10 mMβ-巰基乙醇所得沉澱低溫冷凍真空抽干.
按每mg乾粉加入20μl（可調） UKS液[9.5 M尿素,5mM碳酸鉀,1.25%SDS,0.5%DTT(二硫蘇糖醇),2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc,pH3.5-10),6% Triton X-100],37℃溫育30min,期間攪動幾次,28度 （溫度低,高濃度的尿素會讓溶液結冰）16000 r/min離心15 min,離心力越大時間長一點越好!上清即可上樣電泳.或者-70度保存
六、植物根中蛋白質的抽取
(1) sample,液氮研磨
(2) 裝1.5 ml centrifuge 用tube
(3) 加 1M KH2PO4 K2HPO4 700 ul
(4) 12000 rpm,4度,10-15minite
(5) 取上層液,蛋白質就在裡面

4. 車用尿素是什麼

車輛使來用尿素主要是為了將尾氣中自有害的氮氧化物還原成氮氣和水。一般用於柴油車上。

柴油車的尾氣有害物質主要是氮氧化物和顆粒，在發動機內部可以通過技術手段降低顆粒排放，這樣尾氣里就主要是氮氧化物，採用噴射尿素到尾氣後處理裝置中，尿素在高溫下分解為氨氣，在催化劑的作用下會和氮氧化物反應，生成無害的氮氣和水，這一裝置叫做SCR後處理系統。

汽車上有個專門的尿素箱，尿素就加在這個箱子裡面。只要汽車運轉，就會消耗尿素。所以也要及時添加。一般100升柴油消耗尿素大概4升左右。具體和發動機排量，型號，廠家等有關系。路況不一樣，載重不一樣都會引起尿素消耗量不一樣。

5. 尿素的化學式是什麼

尿素的化學式是CH4N2O。

性狀：無色或白色針狀或棒狀結晶體，工業或農業品為白色略帶微紅色固體顆粒，無臭無味。含氮量約為46.67%。

沸點：196.6°Cat760mmHg。

折射率：n20/D 1.40。

閃點：72.7°C。

溶解性：溶於水、甲醇、甲醛、乙醇、液氨和醇 ，微溶於乙醚、氯仿、苯。弱鹼性。

(5)Urea配製去離子擴展閱讀

對於鋼鐵、不銹鋼化學拋光有增光作用，在金屬酸洗中用作緩蝕劑，也用於鈀活化液的配製。

工業上還用作製造脲醛樹酯、聚氨酯、三聚氰胺-甲醛樹脂的原料,尿素加熱至200℃時生成固態的三聚氯酸(即氰尿酸)。三聚氰酸的衍生物三氯異氰尿酸、二氯異氰酸鈉、異氰尿酸三(2-羥乙酯)、異氰尿酸三(烯丙基)酯、異三聚氰酸三縮水甘油醚、氰尿酸三聚氰胺絡合物等有許多重要應用。

前兩者是新型高檔消毒、漂白劑，三氯異氰尿酸全世界總所產能力超過8萬t。

用於燃燒廢氣脫硝的選擇性還原劑，以及車用尿素，其組成成分為32.5%的高純尿素和67.5%的去離子水。

選擇性催化還原(SCR)排氣後處理是通過尿素在燃燒排氣中熱解反應產生的氨，來與汽車尾氣中的氮氧化物（NOx）進行選擇性催化還原反應的一種技術，是降低燃燒鍋爐和柴油發動機等燃燒廢氣中的有害物質NOx的關鍵而主流的技術。

SCR系統是滿足現代汽車嚴格排放法規例如歐Ⅳ/歐V/ 歐VI（國IV/國V/國VI）法規的必備系統。車用尿素在歐洲叫AdBlue （添藍液），在美國叫DEF（柴油機排氣處理液）。

6. RNA 變性PAGE的配製方法

培養細胞總RNA的提取及鑒定
細胞中含有三類RNA即rRNA、mRNA和tRNA，其中傳遞蛋白質全部遺傳信息是克隆表達功能性蛋白基因的最佳來源，是蛋白質合成的場所,有特殊意義,不同的細胞所表達某種蛋白的mRNA的種類和產量是不同的，為了提高細胞轉錄的mRNA的種類和產量，通常需加入誘導劑來對細胞進行刺激培養，如抗原、病毒、PHA、ConA、LPS等。
提取細胞總RNA的方法，常用強烈變性劑如鹽酸胍溶液處理細胞，我們在細胞凋亡的bcl-2基因的RT-PCR法基因克隆中介紹了異硫氰酸胍一步法，但不純，本文介紹用鹽酸胍來裂解細胞可導致細胞結構破壞，核蛋白二級結構破壞，可利於提取總RNA，也可從總RNA中提取mRNA，從而分析 mRNA表達量，建立cDNA文庫，以及對mRNA的調控和進行反義RNA研究。
變性液：7mol/L鹽酸胍，25m mol/L棕檬酸鈉pH7.0，0.5%Sarkosye，0.1mol/L β-巰基乙醇。
水平衡酚：在飽和酚中加入等體積DEPC處理的三蒸水(或新鮮無菌的三蒸水)混勻後去除水相，再重復處理二次即可。
所用玻璃、塑料製品、金屬器材可用0.1% DEPC水浸泡過夜後消毒無菌，其中玻璃、金屬器材也可用180℃干烤6小時，以去除被污染的RNA酶。
(一)總RNA的提取方法：
1、消化收集細胞方法同前。
2、向離心管中的細胞沉澱物中加1.5mL變性液，立即充分混勻。
3、加入1.5mL水平衡酚、0.15ml 2mol/L乙酸鈉PH4.0、以及0.05mL氯仿，劇烈振盪混勻30秒後，立即置冰上放置15分鍾，4℃ 12000r/min離心15分鍾。
4、取水相，加入等體積酚/氯仿(1:1)混勻，劇烈振盪10分鍾，4℃12000rpm離心15分鍾。
5、取水相，加入等體積氯仿，劇烈振盪10分鍾，再同上離心，再如此反復抽提一次後取水相，加入等體積的預冷的異丙醇(或異戊醇)混勻，低溫放置20分鍾，再同上離心。
6、取沉澱用70%預冷乙醇洗兩次，乾燥10分鍾，溶於DEPC處理的三蒸水中以溶解RNA，分裝,-20℃凍存。
(二)總RNA的鑒定及含量計算
1、RNA純度及含量測定
取少量提取的RNA，經紫外線掃描，吸收峰位於波長260nm處，RNA純度為OD260/OD280=1.8～2。
OD260值為1的RNA溶液約含有40μg/mL，故RNA濃度(μg/mL)=OD260值×40μg/mL×稀釋倍數。
2、RNA分子量大小鑒定
2.1 配液：
(1)10×MOPS電泳緩沖液配製
將41.2g[2-(N-瑪琳代)丙磺鹼，2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MOPS]溶於800mL經DEPC處理的50mmol/L乙酸鈉液中，用2mol/L NaoH調整pH至7.0，加入20mL經DEPC處理的0.5mol/L EDTA(pH8.0)，再加經DEPC處理的水至總體積為1000mL過濾除菌，避光室溫保存。
(2)甲醛加樣緩沖液：1mmol/L EDTApPH8.0、0.25%溴酚蘭、0.25%二甲苯青FF、
50%甘油
2.2 操作步驟：
(1)制平板膠：1.2%瓊脂糖煮沸，冷卻至60℃，加入10×MOPS緩沖液及甲醛溶液，使三者的比例為3.5:1.1:1，或三者的終濃度分別為1.2%、1及10%，於室溫放置30分鍾或更長時間，使膠凝固。
(2)在無菌離心管中混合下列液體。
RNA(最多30μg) 4.5uL
10×MOPS電泳緩沖液 1.0uL
甲醛 3.5uL
65℃溫育15分鍾，水浴冷卻、離心
(3)加入2ul DEPC處理的加樣緩沖液上樣，進行電泳，5V/cm電壓，3小時直到溴酚蘭至膠的中部，可用已知RNA標本作分子量標准品，如28srRNA或9S兔β-球蛋白mRNA。
(4)電泳完畢，取出凝膠，浸泡在溴化乙錠溶液中(終濃度0.5g/L)染色30～45分鍾，紫外透射儀觀察分子量大小。

第二節 核酸蛋白轉移電泳及雜交

一、DNA Southern Blot及雜交
本技術可用於基因組DNA特定序列定位，尤其可分析某些基因的限制性內切酶長度多態性，對遺傳性疾病的早期基因診斷、產前診斷或基因變異等方面的研究有應用價值，其過程包括：樣品DNA內切酶水解、水解片斷的瓊脂糖凝膠電泳分離、分離後水解片斷的轉移(固定)、特異性DNA片斷的分子雜交及放射自顯影。
(一)樣品DNA內切酶水解
限制性內切酶(RE)可裂解雙鏈DNA，每種酶其特點是具有高度特異性的DNA裂解點和不同電離子強度的特殊反應條件。不同產品其反應條件不同，應根據說明書操作。單位(U)RE活性是在37℃ 1小時內能將1μg DNA所有特異性位點切斷的酶用量。若用兩種以上不同的內切酶，要注意RE的最適鹽濃度，要由低向高逐級添加適量鹽逐個進行DNA切割。
1、配液：10×限制性酶消化緩沖液
10×buffer O—無鹽：100mmol/L Tris HCL pH7.4
1mg/mL BSA
100mmoL/L MgCL2
10mmol/L DTT(二硫蘇糖醇)
10×bnffer L—低鹽：緩沖液O
0.5mol/L Nacl
10×bnffer H—高鹽：緩沖液O
1.0mol/L Nacl
2、操作步驟：
(1)將DNA(0.2～1.0μg)溶液加入EP管中,並加入適量H2O總體積為18μL，混勻。
(2)加入2mL 10×限制酶緩沖液，根據廠家建議的鹽濃度選擇不同的緩沖液。
(3)加1～2U限制性內切酶充分混合。
(4)37℃溫育適當時間，時間需先進行預試驗，摸索所需消化的時間，通常用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，酶解充分，各片斷分子量從大到小分布均勻。
(5)加入0.5mol/L EDTA pH8.0使達到終濃度為10mmol/L終止反應。
(6)消化後的DNA直接進行瓊脂糖電泳，方法同前，可用於分析或Southern Blot。
(二)Southern Blot及雜交。
將經電泳走在瓊脂糖中的DNA變性、中和後，以毛細管作用在高鹽緩沖液中轉移至硝酸纖維膜上，再用放射性探針檢測與之雜交的DNA。
1、配液：
(1)變性溶液：1.5mol/L Nacl 0.5mol/L NaoH
(2)中和溶液：200mL 20×SSC
100mL 1mol/L HCL
100mL 1mol/L Tris HCL pH8.0加水至500mL。
(3)20×SSC： 在800mlH2O中溶解175.3g Nacl和88.2g檸檬酸鈉，加入數滴10mol/L NaoH調pH至7.0加水至1000ml，高壓消毒滅菌。
(4)預雜交液：12.5mL 1mol K3 PO4 pH7.4
125mL 20×SSC
25mL 100×Denhardt'S溶液
5mL 5mg/mL魚精DNA
250mL 100%去離子甲醯胺
82.5mL H2O(總體積為500mL)
(5)100×Denhardt'S液：10g聚蔗糖(Ficoll400)
10g聚乙烯吡咯烷硐
10g牛血清白蛋白(組分V)
加H2O至500ml
2、操作步驟(如圖20-1)：

圖20-1 Southern Blot裝置圖
(1)內切酶消化的DNA，總體積為50uL，加入10uL加樣緩沖液進行12-24瓊脂糖電泳。
(2)用溴化乙錠染色，紫外燈下觀察並照像，在膠的旁邊放一尺子。
(3)將電泳膠取出，用以下各溶液浸泡處理，同時輕輕搖動：
500mL 0.2mol/L HCL 10分鍾，水洗若干次
500mL變性液中浸泡15分鍾×2
500mL中和溶液浸泡30分鍾。
(4)剪一張硝酸纖維素膜，每邊小於膠3mm。
(5)剪3～5層濾紙，大小每邊比硝酸纖維膜小7mm，再剪一張濾紙，比膠的寬度長30～40cm，在一盤中加入數百毫升20×SSC，盤上搭一塊玻璃，濾紙可從玻璃雙側浸到盤中的溶液。
(6)逐層放置濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜，其上再鋪濾紙及吸水紙，並加以重物，膠和硝酸纖維膜之間不可有氣泡，轉移24～36小時
(7)取出該膜，用圓珠筆標記方向，放入2×SSC中5分鍾，用濾紙吸干,80℃烘烤2小時。
(8)將該轉移膜放在塑料袋中，加入6～10mL預雜交液，排出氣泡，封口，42℃ 3小時或過夜。
(9)將標記的DNA探針煮沸5分鍾，立即冷卻，加入雜交液中，濃度為5×105 CPM/ML。
(10)倒去預雜交液，加入含探針的雜交液封口，42℃ 6h或過夜。
(11)取出轉移膜，按以下條件洗膜
1×SSC，0.1%SDS室溫2×15分鍾
0.25SSC，0.1%SDS,42℃ 2×15分鍾，氣中乾燥。
(12)將雜交後的膜曝光於X光片，暗盒中放射自顯影2～7天，-70℃。
(13)X片顯影、定影，然後讀片
結果分析：此雜交技術可以對基因結構進行分析。雜交陰性帶的大小，分布規律及根據帶條信號強度測量其含量。
二、RNA Northern Blot及雜交
此法是將RNA分子在變性瓊脂糖凝膠中可相互分離，隨後將RNA轉移至硝酸纖維素濾膜上，用放射性標記的探針進行DNA-RNA雜交，此法是研究RNA(特別是mRNA)的主要方法之一，可測量RNA的含量和大小。
1、配液：Northern 預雜交液：12.5m 1mol/L K3PO4 pH7.4
125mL 20×SSC
25mL 100×Danhardt's液
5mL 5mg/mL 魚精DNA
250mL 100%去離子甲醯胺
加H2O 至500mL-20℃貯存
Northern 雜交液：500mL預雜交液加入標記探針及10%磷酸葡聚糖。
2、操作步驟：
(1)RNA變性電泳方法同前
(2)待溴酚蘭走至膠的中部時，用水清洗膠數次，放置於500mL 10×SSC中浸泡45分鍾，輕輕搖動。
(3)測量膠的大小，按下列順序，從下向上為①橫跨玻璃雙側的濾紙，雙邊可浸至20×SSC溶液；②膠；③硝酸纖維素濾膜；④親和層吸紙；⑤吸水紙；⑥重物、轉移4～6小時。
(4)取出濾膜80℃烘烤2小時。
(5)用6～10mL Northern預雜交液，42℃預雜交過夜。
(6)將已標記的探針煮沸，立即冷卻，加入6～10mL Northern雜交液。
(7)去除預雜交液，加入含探針的雜交液，42℃，雜交過夜。
(8)按下列條件洗膜：1×SSC 0.1%SDS室溫2×15分鍾
0.25×SSC 0.1%SDS室溫2×15分鍾
(9)曝光於X光片暗盒中放射自顯影1天。顯影，定影，根據自顯影條帶的位置判定特定片斷的位置和順序，也可測含量。
三、蛋白Western Blot及分析
此項技術是一種蛋白質的固定和分析技術，是將已用聚丙烯醯胺凝膠或其它凝膠或電泳分離的蛋白質轉移到硝酸纖維濾膜上，固定在濾膜上的蛋白質成分仍保留抗原活性及與其它大分子特異性結合的能力，所以能與特異性抗體或核酸結合，其程序Sonthern Blot相似，故稱為Western Blot,第一抗體與膜上特異抗原結合後，再用標記的二抗(同位素或非同位素的酶)來檢測，此方法可檢測1ng抗原蛋白。
1、配液：
(1)轉移電泳緩沖液：20mmol/L Tris HCL pH8.0
150mmol/L 甘氨酸
加14.5g Tris粉 67.08g甘氨酸於4L水中，加入1200mL
甲醇，加水至6L
(2)麗春紅S溶液：0.5%麗春紅S
1%乙酸
2、操作步驟（如圖20-2）：

圖20-2 Western Blot裝置圖

(1)用已制備好的SDS-PAGE分離的蛋白凝膠。
(2)用一張濾紙，剪成與膠同樣大小，在轉移電泳緩沖液中預濕，放在Scotch-Brit Pad上，在膠的陰性端放上濾紙，膠的表面用該緩沖液浸濕，排出所有氣泡。
(3)在膠的陽極面放置同樣大小浸濕的硝酸纖維素膜，排出氣泡，再在濾膜的陽極端放置一張濾紙，排出氣泡，再放一個Scotch-Brit Pad。
(4)將以上「三明治」樣裝置放入一個塑料支撐物中間，將支撐物放入電轉移裝置中，加入電轉移緩沖液。
(5)接通電源：使膠上的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，電壓為14V 4℃轉移4小時或過夜。
(6)將濾膜放入麗春紅S溶液中5分鍾，蛋白染色水中脫色2分鍾，照像，用印度墨水將分子量標准染色，在水中完全脫色。
(7)將濾膜放在塑料袋中，每3張加入5mL封閉緩沖液(1克速溶去脂奶粉溶於100ml PBS中)，封閉特異性抗體結合位點，室溫1h，搖動，倒出封閉緩沖液。
(8)在封閉緩沖液中稀釋第一抗體，加入後室溫放置1小時，將濾膜轉到塑料盒中，用200mL PBS洗四次，搖動。
(9)在封閉緩沖液中稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗，重復步驟8。
(10)將濾膜放在100mL新配製的DAB底物溶液中，大約2～3分鍾就可顯色，用水沖洗終止反應、照像。
結果分析：分析陽性(顯色)條帶的分子量大小，而且根據信號(顏色)強弱分析蛋白表達量。

第三節 細胞的原位雜交技術

原位雜交(ISH)是一種可在細胞塗片、組織切片以及分裂中期染色體帶中檢測DNA或RNA的技術，此方法原理是由DNA或RNA的序列與互補的標記單鏈DNA/RNA探針結合形成標記的雙鏈雜交分子，本技術可對組織細胞原位的待測核酸分子進行定性，定量及定位分析。在細胞分化調節、基因定位、腫瘤遺傳學、分子病理學、病毒學等領域得到廣泛應用。經典的原位雜交技術包括載玻片處理，組織細胞的固定，探針的制備或選購，原位雜交，洗滌以及檢測，其中探針制備技術不屬於本章專業技術，故不作具體評敘，略交待制備使用原則。本章節主要介紹培養細胞的原位雜交技術。
一、探針的制備原則和選擇
探針為RNA或雙鏈、單鏈DNA，雙鏈探針較單鏈探針有很多缺點，探針必須變性、復性，降低了探針雜交效率，雙鏈探針在溶液中形成長的鏈狀結構傾向，限制了它的組織穿透能力。適用於基因組DNA雜交。由於原位雜交的探針將與高密度的細胞融合，因此，需要減短探針的長度或增加探針的濃度，但是過高濃度的探針往往會增加非特異性結合，因此每種探針應選擇適當的濃度。
探針的獲得常採用隨機引物延伸法的PCR合成和擴增，可獲大量的DNA探針，或利用帶有噬菌體強啟動子多克隆位點的質粒載體來合成RMA探針，也可利用質粒菌擴增質粒，經酶切後純化的基因片斷，均可以獲得制備探針原料。這些探針可以用同位素標記，也可以用非同位素標記，即光敏生物標記或地高辛配基標記於脫氧脲嘧啶三磷酸核苷(dUTP)上形成的地高辛-dUTP，可通過隨機引物或缺口平移法與探針的核酸分子相連，構成地高辛一配基標記的核酸探針。比探針可用抗地高辛抗體偶聯酶或熒光素通過松體結合和底物顯色或產生熒光來檢測。
這些探針基本均有市售，無需自行制備，只要根據說明書使用即可。
二、載玻片和蓋玻片預處理
為了防止探針的非特異貼附而保證細胞粘附而需處理：
1、用於檢測RNA的載玻片的處理
(1)用0.1mol/L HCL洗載玻片20分鍾，再用無水乙醇洗數次使其乾燥。
(2)在下列溶液中，65℃處理2小時
3×SSC 0.02%FicoLL400 0.02%聚乙稀吡咯烷酮(PVP)。
(3)固定在乙醇/乙酸(3:1 V/V)20分鍾，180℃烘烤2小時。
2、用於檢測DNA的載玻片的處理
以TESPA(three-amino-propyl-triethoxy-silane)塗載玻片。
3、對於蓋玻片：於0.1mol/L HCL中浸泡20分鍾，用無水乙醇洗，乾燥後用二甲基氯化硅硅化，180℃烤2小時。
三、組織細胞固定
理想的細胞固定過程應該保護細胞形態，同時確保目的基因DNA或RNA序列暴露。對於RNA-RNA原位雜交有效的固定劑是4%多聚甲醛和PLPD（磷酸緩沖液PBS、賴氨酸、過碘酸鹽及重酪酸鹽）。
1、塗片細胞原位雜交固定
(1)用含有0.02%EDTA的PBS洗滌細胞，於0.1%胰蛋白酶消化，收獲細胞計數，塗載玻片上。
(2)若檢測RNA，固定於4%多聚甲醛pH7.0，在4℃下放60分鍾，PBS洗5分鍾，系列乙醇脫水乾燥，-20℃保存。
(3)若檢測DNA，固定在4%多聚甲醛16～24小時，0.1mol/L Tris-HCL pH7.4洗2×5分鍾，浸泡在下述溶液中2×5分鍾：
0.25%(v/v)Tritonx-100；0.25%(v/v)Nonidet P40；0.1mol/L Tris-HCL pH7.4；再用0.1mol/L Tris-HCL pH7.4洗2×5分鍾。
(4)在100μg/ml蛋白酶K，50mmol/L Tris-HCL PH8.0，5mmol/L EDTA溶液中，37℃處理10分鍾，再用含有甘氨酸的0.1mol/L Tris-HCL PH7.4洗2×5分鍾。
(5)在20%(v/v)乙酸中40℃處理15分鍾，0.1mol/L Tris-HCL PH7.4洗2×5分鍾。
注意：對於DNA-DNA原位雜交多聚甲醛或福爾馬林均可，但對於地高辛檢測法必須用4%多聚甲醛，固定至少16小時，而且用蛋白酶K處理，這樣可明顯減少背景染色。
四、原位雜交
原位雜交與鹽濃度、溫度、甲醯胺濃度、pH等有關，DNA復性的溫度是16～32℃，DNA-RNA原位雜交，25℃最佳，RNA-DNA雜交，可用較高溫度，在pH5～9范圍內復性率基本上與pH無關。最好選用溫和的鹼性條件。甲醯胺有機溶劑可降低雙鏈核酸的穩定性，可避免雜交過程中處於過高的溫度，防止高溫破壞組織。
(一)同位素標記DNA探針的原位雜交
同位素標記的DNA探針，敏感性高，但要注意非特異結合，如35S標記探針在雜交前，用未經標記的dUTP預雜交，可減少非特異，可獲較好的細胞內定位，此外還常用3H或125I標記探針，但3H放射線弱，自顯影需100天曝光，不太理想，方法如下：
(1)取已形成單層的細胞的蓋玻片，懸浮細胞可採用離心法，將細胞粘附到塗有明膠的載玻片上。組織印片，冰凍切片等標本。
(2)將標本浸入甲醇固定5分鍾，再過3次4℃預冷的10%三氯醋酸。
(3)將細胞片標本浸入70%乙醇脫水，空氣乾燥，這時培養細胞蓋玻片應該用中性樹膠固定於載玻片上，注意細胞面向上。
(4)將細胞片放置在金屬盤內，並將托盤放入43℃水浴箱中預熱。
(5)直接向固定的細胞面滴加5mL含探針雜交液，然後用16mm蓋玻片覆蓋，其邊緣用橡膠液封閉。
(6)43℃恆溫水浴箱內培養18小時，此間保持箱內高濕度，防止因蓋玻片封閉不嚴導致雜交緩沖液乾涸。
(7)反應結束後，將玻片置於冰塊上，用鑷子小心剝下蓋玻片周邊的橡膠，將載玻片浸入垂直2×SSC溶液中，使蓋玻片脫落。
(8)將載玻片放入濕盒中，加2×SSC溶液浸沒玻片，加蓋玻片並用膠帶封閉濕盒。然後，將濕盒移入水浴箱中53℃處理30分鍾。
(9)在18℃用2×SSC洗玻片4次，每次5分鍾。
(10)玻片浸入70%乙醇脫水，空氣乾燥。
(11)將乾燥後的乾燥標本浸入新配製的核4乳膠液（核4乳膠液蒸餾水=1:1），垂直取出玻片，用濾紙擦去背面多餘膠，室溫乾燥5小時（在暗室中進行）。
(12)用黑紙包裹標本放在4℃冰箱曝光（3H標記的探針通常需2～4周，有時需長達100天，可造成高背景，而不理想）。
(13)按常規顯影、定影、水洗。
(14)對標本進行Giemsa或HE染色、脫水、封片。
結果分析：鏡下觀察，如需定量，可在鏡下計數銀顆粒或拍攝顯微照片，用圖象分析儀進行灰度分析。
(二)同位素標記RNA探針的原位雜交
RNA探針容易制備，合成率較高，成本低，易純化，可提高檢測敏感性。DNA-RNA、RNA-RNA雜交比DNA-DNA雜交穩定，能適應更多的條件。
(1)標本處理同前
(2)將RNA標記探針溶於雜交緩沖液中（5×107CPM/ml放射強度）。
50～70%去離子甲醯胺 2×SSC
0.5×Denhardt's液 1mmol/L EDTA pH7.0
200μg/mL變性魚精DNA 85℃ 5分鍾
(3)每張載玻片上滴加雜交液，使每張載玻片探針總量為2×105CPM，用一硅化的蓋玻片蓋住，封以不透性礦物油，在利於探針的溫度下（常為42℃）雜交7～18小時。
(4)用氯仿洗數次，去除礦物油，室溫下使蓋玻片在2×SSC液中滑落，再滴加50%～70%去離子甲醯胺，0.1×SSC液，雜交溫度下60分鍾，室溫2×SSC洗5分鍾，用50μg/mL RNaseA在2×SSC中消化去除單鏈RNA，再滴加50%～70%去離子甲醯胺，0.1×SSC,室溫15分鍾，室溫下用0.1×SSC洗5分鍾。
(5)將切片脫水，浸入由1%甘油稀釋的放射自顯影乳劑（1:1）中，放入暗盒中，在有硅膠乾燥劑存在下-70℃，存放5天（或者曝光於X光膠片24～48小時），隨後浸於液體乳劑。
(6)用HE染色。
(三)地高辛標記的DNA探針原位雜交
放射性同位素標記探針缺點是有放射損傷，易污染環境，需特殊防護和實驗條件，有半衰期受限、標記不穩定及曝光時間長。若改用生物素、乙醯氨基、熒光或地高辛標記可避免，其中以地高辛標記探針最敏感，隨機引物標記地高辛，其標記率很高，此探針用於原位雜交可獲高敏感性，好的細胞定位以及低背景。非同位標記探針還可以通過雙標記原位雜交法，同時測多條DNA序列。
(1)配液：①雜交緩沖液：2×SSC
5%（W/V）磷酸葡聚糖
50%去離子甲醯胺
②緩沖液I： 0.1mol/L Tris-HCL pH7.5
0.5mol/L Nacl
③緩沖液II： 0.1mol/L Tris-HCL pH9.5
0.1mol/L Nacl
5mmol/L MgCl2
(2)操作步驟：
①組織標本處理同前。
②將140ng/mL地高辛標記的探針加到雜交緩沖液中，每張滴加50μL雜交緩沖液，用蓋玻片蓋住，四周封以樹膠。
③將目的DNA和DNA探針放入90℃，進行變性10分鍾，雙鏈打開，42℃，在潮濕環境中雜交16小時。
④去除蓋玻片，按下列條件洗滌：
2×SSC室溫10分鍾→2×SSC室溫10分鍾→0.2×SSC室溫10分鍾→0.2×SSC 42℃ 20分鍾。
⑤再按以下方法處理：
1) 在緩沖液I中洗30分鍾。
2) 在含有20%羊血清的緩沖液I中洗30分鍾。
3) 滴加1:5000標有鹼性磷酸酶或辣根過氧化物酶的地高辛抗體，在裝有緩沖液I的濕盒中溫育20分鍾。
4) 在緩沖液I中洗2×20分鍾。
5) 在緩沖液II中洗60分鍾。
6) 加入下述溶液：緩沖液II
0.33mg/mL 四唑氮蘭
0.17mg/mL 5-bromo-4-Chlora-3-indoly' phosphate
7) 將切片浸於20mmol/L Tris-HCL pH7.5，5mmol/L EDTA終止反應。
⑥ 用底物顯色、復染、脫水、封片，按免疫組化常規法進行。
說明：
(1)用不同濃度和不同溫度的鹽溶液洗滌是為了去除探針與不完全同源序列雜交，減少非特異性顯色，其原則鹽濃度由高到低，溫度由低到高洗滌，洗滌過程中切勿使切片乾燥。
(2)應該有陽性和陰性對照，陽性對照：用該探針與已知含互補序列的組織細胞標本進行雜交。陰性對照：①應用RNA酶或DNA酶去除目的序列；② 使用未標記探針；③不加核酸探針進行雜交（空白對照）；④用不含探針DNA的無關質粒DNA替代探針進行雜交；⑤同義RNA（Sense probe）進行雜交。

7. 怎樣自己配置車用尿素

車用尿素液是32.5%的車用尿素和67.5%的去離子純凈水配置而成的，自己是沒辦法簡單勾兌的。
最重要的是，使用不合格的尿素，容易損壞SCR系統，造成的損失會更大。建議您去正規經銷商購買合格車用尿素液，不要撿了芝麻丟了西瓜。

8. 雙向電泳水化液配方: 8M Urea, 1%DTT, 2%CHAPS, 0.5%微升兩性電解質。配製50ml，固體應稱量多少克

urea就按照50mL 中8M的濃度來算（分子量等）
DTT 和CHAPS一般是mM的濃度吧？如果是1%的話就應該按照100mL 對應1g的標准來算了。