蛋白純化濃縮換液超濾

A. 超濾濃縮蛋白溶液時其濃度該從高到低還是有低到高對超濾膜好呢

從低到高,當然首先3瓶中蛋白分子量應該差不多,否則先超濾小分子的,主要是減少超濾膜的堵塞程度

B. 蛋白用超濾管濃縮容易沉澱怎麼辦

可能是這個蛋白的水溶性較差，也就是只能保持在一定濃度不能太高
另外就內和這個蛋白容的穩定性有關了，超濾時保持低溫，體積縮小一點後就把濾液混勻避免局部濃度過高，選擇更合適的緩沖液，添加一點甘油等小分子物質等都可以增加蛋白的穩定性。

C. 【求助】超濾能否脫鹽和濃縮一步完成啊

昨天有個millipore的技術人員就是這樣說的~HarveyWang(站內聯系TA)本人主要是從發酵液中提取酶,文獻上一般的步驟是先用硫酸銨沉澱,然後透析,再用超濾濃縮,最後冷凍乾燥, 這要看你需要做多大的體積了。:) (1)硫酸銨沉澱法：我的觀點是，如果你1000 mL的發酵液的話，硫酸銨沉澱可以用，但是這浪費多少硫酸銨啊？！做學術研究可以，如果你的課題是計劃做提取酶的工藝和中試的話，這種硫酸銨沉澱並不有太大的實用性。 （2）超濾步驟的選用要看你的酶溶液有多大的體積。 如果發酵液的酶的量並不是很濃的話，例如50 mL 10 mg/L的酶量，用這種超濾膜會損失掉大部分你的目地酶，都粘到膜上去了，很難洗下來（稀的NaOH可以）。不能輕信某品牌銷售說的話，用用就知道了。如果你的濃縮液體積比較大，例如100-500 mL，酶的濃度也很高，這是可以用超濾膜的。 （3）對於小體積的脫鹽透析，透析袋很好用的。這里是指10 mL-100 mL。從操作方便性上看，這個在小型試驗中我最喜歡用。好簡單啊。。。。 自己頂一個,解答的詳細的有重獎!(金幣可以再加) （1）發酵液的酶蛋白濃度大約是多少，純度是多少？發個SDS-PAGE看看，註明上樣量。 （2）硫酸銨沉澱後和透析後可上離子交換，這可以濃縮10-1000倍，還可以有純化效果，然後再冷凍濃縮啊。HarveyWang(站內聯系TA)哈哈哈哈，回帖就有金幣拿:Ddaidai0124(站內聯系TA)本人現在只是小規模的提取酶,馬上要上發酵罐,需要大規模的提取酶液,不是做酶學性質,所以酶的純度要求不高,和工業用酶的純度差不多就可以了!希望大家推薦個適合工業化提取酶液的工藝,主要考慮成本問題.請版主幫忙在增加懸賞金幣20個lvgl158(站內聯系TA)起碼知道 它的分子量 才能知道是否可以用同一個膜 如果小於一萬可能就有點難度 可以先用少量的硫酸銨澄清 離心後 進行超濾 在超濾前 必須的保證液體 清澈hezhao999(站內聯系TA)體積的在200ml以上用超濾儀，200ml以下可以用超濾離心管，如果不知分子量選用1000的膜完全可以了，如果知道分子量，則選擇酶分子量1/5的超濾膜。zhaocy8903(站內聯系TA)多大規模的發酵 多大規模的發酵

D. 如何利用透析法進行脫鹽濃縮蛋白

二、蛋白質的分離純化
蛋白質的分離純化方法很多，主要有：
（一）根據蛋白質溶解度不同的分離方法
1、蛋白質的鹽析
中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質的溶解度增加，此稱鹽溶；當鹽濃度繼續升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降並先後析出，這種現象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4)有很強的水化力，可奪取蛋白質分子的水化層，使之「失水」，於是蛋白質膠粒凝結並沉澱析出。鹽析時若溶液pH在蛋白質等電點則效果更好。由於各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉澱。
影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質溶介度降低。但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低，更容易鹽析。（2）pH值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質濃度：蛋白質濃度高時，欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉澱出來（共沉現象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質含量在2.5-3.0%。
蛋白質鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。
其中應用最多的硫酸銨，它的優點是溫度系數小而溶解度大（25度時飽和溶液為4.1M，即767克/升；0度時飽和溶解度為3.9M，即676克/升），在這一溶解度范圍內，許多蛋白質和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當用其他pH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調節。
蛋白質在用鹽析沉澱分離後，需要將蛋白質中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質溶液裝入秀析袋內（常用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，並不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。
2、等電點沉澱法
蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質的等電點有差別，可利用調節溶液的pH達到某一蛋白質的等電點使之沉澱，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結合用。
3、低溫有機溶劑沉澱法
用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數蛋白質溶解度降低並析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質較易變性，應在低溫下進行。
（二）根據蛋白質分子大小的差別的分離方法
1、透析與超濾
透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。
超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質分子通過半透膜，而蛋白質留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。
2、凝膠過濾法
也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex
ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。
（三）根據蛋白質帶電性質進行分離
蛋白質在不同pH環境中帶電性質和電荷數量不同，可將其分開。
1、電泳法
各種蛋白質在同一pH條件下，因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質作為載體，電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度，當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時，到達各自等電點的pH位置就停止，此法可用於分析和制備各種蛋白質。
2、離子交換層析法
離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT
FACE="宋體"
LANG="ZH-CN">纖維素），當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，隨後用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。（詳見層析技術章）
（四）根據配體特異性的分離方法－親和色譜法
親和層析法（aflinity
chromatography）是分離蛋白質的一種極為有效的方法，它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價地結合。其基本原理：蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質，因此蛋白質的分離（Separation），提純（Purification）
和鑒定（Characterization）是生物化學中的重要的一部分，至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質從復雜的混合蛋白質中提取出來，因此往往採取幾種方法聯合使用。
細胞的破碎
1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置於筒內約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調速器先撥至最慢處，開動開關後，逐步加速至所需速度。此法適用於動物內臟組織、植物肉質種子等。
2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置於管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎，此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用於量少和動物臟器組織。
3、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震盪破裂，此法多適用於微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鍾，此法的缺點是在處理過程會產生大量的熱，應採取相應降溫措施。對超聲波敏感和核酸應慎用。
4、反復凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由於細胞內冰粒形成和剩餘細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。
5、化學處理法：有些動物細胞，例如腫瘤細胞可採用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞，細菌細胞壁較厚，可採用溶菌酶處理效果更好。

無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內蛋白質或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物質量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺醯氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合於目的物質的提取。
濃縮、乾燥及保存
一、樣品的濃縮
生物大分子在制備過程中由於過柱純化而樣品變得很稀，為了保存和鑒定的目的，往往需要進行濃縮。常用的濃縮方法的：
1、減壓加溫蒸發濃縮
通過降低液面壓力使液體沸點降低，減壓的真空度愈高，液體沸點降得愈低，蒸發愈快，此法適用於一些不耐熱的生物大分子的濃縮。
2、空氣流動蒸發濃縮
空氣的流動可使液體加速蒸發,鋪成薄層的溶液，表面不斷通過空氣流；或將生物大分子溶液裝入透析袋內置於冷室，用電扇對准吹風，使透過膜外的溶劑不沁蒸發，而達到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適於大量溶液的濃縮。
3、冰凍法
生物大分子在低溫結成冰，鹽類及生物大分子不進入冰內而留在液相中，操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然後緩慢地融解，利用溶劑與溶質融點介點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質和酶的鹽溶液用此法濃縮時，不含蛋白質和酶的純冰結晶浮於液面，蛋白質和酶則集中於下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質和酶的濃縮液。
4、吸收法
通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學反應，對生物大分子不吸附，易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋裡，外加聚乙二醇復蓋置於4度下，袋內溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水飽和後要更換新的直至達到所需要的體積。
5、超濾法
超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方法，不液體在一定壓力下（氮氣壓或真空泵壓）通過膜時，溶劑和小分子透過，大分子受阻保留，這是近年來發展起來的新方法，最適於生物大分子尤其是蛋白質和酶的濃縮或脫鹽，並具有成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性，回收率高等優點。應用超濾法關鍵在於膜的選擇，不同類型和規格的膜，水的流速，分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量值）等參數均不同，必須根據工作需要來選用。另外，超濾裝置形式，溶質成份及性質、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響。Diaflo
超濾膜的分子量截留值：
膜名稱分子量截留值孔的大的平均直徑
XM－300300，000140
XM－200100，00055
XM－5050，00030
PM－30 30，00022
UM－2020，00018
PM－1010，00015
UM－21，00012
UM05500 10

用上面的超濾膜製成空心的纖維管，將很多根這樣的管攏成一束，管的兩端與低離子強度的緩沖液相連，使緩沖液不斷地在管中流動。然後將纖維管浸入待透析的蛋白質溶液中。當緩沖液流過纖維管時，則小分子很易透過膜而擴散，大分子則不能。這就是纖維過濾秀析法，由於透析面積增大，因而使透析時間縮短10倍。

E. 蛋白在超濾管濃縮過程中出現沉澱怎麼辦

1、選擇合適的超濾管，主要考慮MWCO和濃縮體積，最常見的是Ultra-15（10kD）。
通常應截留分子量不應專大於目的蛋屬白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量為35kDa，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管。
若目的蛋白分子量為10kD左右，則可以用截留分子量3kD的超濾管。認真閱讀使用說明書，注意超濾膜對各種化學物質的耐受程度有所不同，表格中有。

2、新買來的超濾是乾燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全過膜，冰浴或冰箱里預冷幾分鍾。然後將水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超過管頂的白線為准。操作要輕，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預冷。

3、平衡。質量和重心二者都要達到平衡。注意轉速和加速度不可太快，否則直接損壞超濾膜。

注意，一定要等離心機達到目的轉速之後，方可離開
離心機，否則離心機出問題時，無法第一時間處理，後果不可預測！膜與轉軸的方向根據說明書調整（角轉離心機的情況是膜與軸垂直）。在實際使用中，一般轉速開的比說明書里的要低，這樣可以延長離心管的使用壽命。

F. 蛋白純化過程中，超濾能除咪唑嗎

您好！可以的，但是超濾除的不是很乾凈，用分子篩干凈些。

網路教育團隊【海納百川團】為您解答。
感謝您的採納 O(∩_∩)O 。如有疑問，歡迎追問。

G. 工業生產蛋白,提取液脫鹽用什麼方法超濾還是離子交換樹脂好些理由是什麼比如成本和效率方面

超濾，用於截留水中膠體大小的顆粒，而水和低分子量溶質則允許透過膜。由膜表面機械篩分、膜孔阻滯和膜表面及膜孔吸附的綜合效應，以篩濾為主。所以超濾不能做為脫鹽設備，一般用在反滲透前做除鹽水預處理設備。
如果在你的問題中選的話只能用離子交換樹脂了。

離子交換法是以圓球形樹脂(離子交換樹脂)過濾原水，水中的離子會與固定在樹脂上的離子交換。常見的兩種離子交換方法分別是硬水軟化和去離子法。硬水軟化主要是用在反滲透(RO)處理之前，先將水質硬度降低的一種前處理程序。軟化機裡面的球狀樹脂，以兩個鈉離子交換一個鈣離子或鎂離子的方式來軟化水質。 離子交換樹脂利用氫離子交換陽離子，而以氫氧根離子交換陰離子；以包含磺酸根的苯乙烯和二乙烯苯製成的陽離子交換樹脂會以氫離子交換碰到的各種陽離子(例如Na+、Ca2+、Al3+)。同樣的，以包含季銨鹽的苯乙烯製成的陰離子交換樹脂會以氫氧根離子交換碰到的各種陰離子(如Cl-)。從陽離子交換樹脂釋出的氫離子與從陰離子交換樹脂釋出的氫氧根離子相結合後生成純水。 陰陽離子交換樹脂可被分別包裝在不同的離子交換床中，分成所謂的陰離子交換床和陽離子交換床。也可以將陽離子交換樹脂與陰離子交換樹脂混在一起，置於同一個離子交換床中。不論是那一種形式，當樹脂與水中帶電荷的雜質交換完樹脂上的氫離子及(或)氫氧根離子，就必須進行「再生」。再生的程序恰與純化的程序相反，利用氫離子及氫氧根離子進行再生，交換附著在離子交換樹脂上的雜質。

H. 同一個超濾濃縮管可以用來純化不同的蛋白嗎

不可以的
不管是哪個公司生產超濾濃縮管使用後都會有蛋白殘留在濾膜上，而不管是使用氯版化鈉或者氫氧權化鈉清洗都不能確保可以完全清理掉殘留在膜上的蛋白。
如果不同的蛋白間混合使用，可能前一個蛋白會污染到後一個蛋白，甚至有些某些高活性的酶殘留在上面會造成後一個蛋白被酶切降解，造成不必要的損失。

I. 純化的單克隆抗體，超濾濃縮的時候會把磷酸鹽離心掉導致抗體的緩沖環境變成水嗎

不會來的。。。
超濾濃縮對於自緩沖液成分不會有任何改變的，因為PBS中的磷酸根離子也好，氯離子也好，鈉離子也好都是很小的離子，可以在溶液中自由擴散，不會因為超濾離心就被甩到下層濾液中去。
你可以做個簡單的實驗，取一定體積PBS溶液測一下pH值和電導率值，之後用超濾管去離心。取出上層未被濾完的溶液再測一下pH值和電導率值，會發現pH值和電導率值和之前測的是一樣的。即可證明未被濾完的溶液還是PBS溶液，而不是水。

J. 我的樣品層析下來後約超過1L，是否有合適的超濾系統可進行最後一步的濃縮換液

有試過賽多利斯有全自動超濾系統Sartoflow Smart嗎？最小循環體積20ml，完全能夠對1L的樣品進行快速超濾換液。