離子交換鹽酸胍
Ⅰ 尿素包涵體蛋白可以用離子交換純化嗎
包涵體用8M尿素還不溶解該怎麼①包涵體就是蛋白的變性聚集後的產物，6M鹽酸胍及8M尿素專是作為溶解包涵屬體的溶劑。②復性的過程是逐步去除鹽酸胍或者尿素，從而使得蛋白天然構象逐步形成。所以一般如果起始使用的是6M鹽酸胍進行包涵體溶解，這個過程中逐步降低的是鹽酸胍的濃度。
Ⅱ 陰離子交換樹脂價格
隨著科技的進步，一種新型的用於提取的材料出現。現今，工業上利用陰離子交換樹脂進行水的凈化處理以及純水的製作，甚至污水的處理過程都開始運用陰離子交換樹脂。這不可謂是一種新材料的應用進步，新式的材料正逐漸走進我們的生活，從工業領域慢慢過渡到我們日常生活的方方面面。下面小編就來帶大家了解一下陰離子交換樹脂的具體內容。
陰離子交換樹脂價格
含有氫氧根離子的樹脂,根據電離常數的大小,可分為強鹼性、中等鹼性和弱鹼性三類。強鹼性陰離子交換樹脂,主要是分子中含有季銨基-N(CH₃)3OH的樹脂。弱鹼性陰離子交換樹脂,有間苯二胺-甲醛樹脂、三聚氰胺-胍·甲醛樹脂等。
聖泉酸性離子交換樹脂001×7、201×7混床專用陰陽離子交換樹脂￥2.5
疁星201x7(717)強鹼性陰離子交換樹脂￥1
恆泰專業生產201X7強鹼性陰離子交換樹脂￥9
陰離子交換樹脂分類介紹
離子交換樹脂交換能力依其交換能力特徵可分：
1.強鹼型陰離子交換樹脂：主要是含有較強的反應基如具有四面體銨鹽官能基之-N+(CH3)3，在氫氧形式下，-N+(CH3)3OH-中的氫氧離子可以迅速釋出，以進行交換，強鹼型陰離子交換樹脂可以和所有的陰離子進行交換去除。
樹脂在使用一段時間後，要進行再生處理，即用化學葯品使離子交換反應以相反方向進行，使樹脂的官能基團回復原來狀態，以供再次使用。如上述的陽離子樹脂是用強酸進行再生處理，一般上使用鹽酸以1：10的比例稀釋後清洗，此時樹脂放出被吸附的陽離子，再與H+結合而恢復原來的組成。
2.弱鹼型陰離子交換樹脂：這類樹脂含弱酸性基團，如羧基-COOH，能在水中離解出H+而呈酸性。樹脂離解後餘下的負電基團，如R-COO-(R為碳氫基團)，能與溶液中的其他陽離子吸附結合，從而產生陽離子交換作用。這種樹脂的酸性即離解性較弱，在低pH下難以離解和進行離子交換，只能在鹼性、中性或微酸性溶液中(如pH5～14)起作用。這類樹脂亦是用酸進行再生(比強酸性樹脂較易再生)如氨基，僅能去除強酸中的陰離子如SO42-，Cl-或NO3-，對於HCO3-，CO32-或SiO42-則無法去除。
陰離子交換樹脂用途
陰離子交換樹脂主要用於純水、高純水的制備，廢水處理，生化製品的提取，放射性元素提煉，抗菌素分離等及濕法冶金中鎢、鉬的提取。例如：工業水處理，熱電廠硬水軟化，高純水制備，脫鹽脫鹼水制備，凝結水處理，工業廢水處理等領域。
以上就是小編分享的關於陰離子交換樹脂的相關內容，在進行使用時，我們也要注意，保持一定水分並且保持一個適合溫度，在正常使用時保持雜質去除。而且不能忘記定期活化處理以及對新樹脂預處理，這些工序都是要進行細致的操作的，細微的錯誤都可能導致最後的失敗，希望大家慎重的來挑選材料。以上就是我們的分享，希望對大家有所幫助。
Ⅲ 粗多糖的提取中，用了6次的EDAE凝膠層析柱流速過慢，怎樣去活化
EDAE是哪種凝膠柱？
是不是弱陰離子交換柱DEAE？
如果是DEAE的話給你一點清洗的參考
一，在位清洗
1， 用2M的NaCl至少清洗2個柱體積。
2， 用1M的NaOH 至少清洗4個柱體積。
3， 用2M的NaCl至少清洗2個柱體積。
4， 用至少2個柱體積的蒸餾水潤洗層析柱。
二，去除沉澱的蛋白質：
1， 注入一個柱體積的胃蛋白酶（1mg/ml in 0.5M NaCl,0.1M acetic acid）。室溫過夜或37°作用1小時。
2， 用至少2個柱體積的蒸餾水潤洗層析柱。
3， 用至少4個柱體積的儲存緩沖液沖洗。
也可以選用如下操作
1， 用6M鹽酸胍沖洗2個柱體積。
2， 立即用pH7-8的緩沖液沖洗至少5個柱體積。
3， 用至少2個柱體積的蒸餾水潤洗分離柱。
4， 用至少4個柱體積的儲存緩沖液沖洗。
三，去除脂類，疏水結合蛋白質或脂蛋白：
1， 如需徹底除去此類污染物，可使用有機溶劑或去污劑。
2， 在使用有機溶劑前，用蒸餾水沖洗填料至少4個柱體積以避免鹽類沉澱於層析柱中。
3， 在使用有機溶劑或溶液時，需要減小流速以避免分離柱超壓。
4， 清洗溶液最大濃度如下，100%的異丙醇，100%的甲醇，100%的乙腈，2M的氫氧化鈉，75%的乙酸，100%的乙醇，離子性或非離子型去污劑。
5， 避免使用陰離子去污劑。
Ⅳ 凝固點下降法測定尿素的分子量寒劑溫度過高過低有什麼影響
反相液相色譜柱效高、分離能力強、保留機理清楚，是液相色譜分離模式中使用最為廣泛的一種，對於生物大分子、蛋白質及酶的分離分析，反相液相色譜正受到越來越多的關．反相色語法是以表面非極性載體為固定相，面以比固定相極性強的溶劑為流動相的—種液相色譜分離模式．反相色譜固定相大多是硅膠表面鍵合疏水基團，基於樣品中的不同組分和疏水基團之間疏水作用的不同而分離．在生物大分子分離中，多採用離子強度較低的酸件水溶液，添加一定量乙腈、異內醇或甲醇等與水互溶的有機溶劑作流動相．普通的反相色譜固定相和孔徑大於300?的硅膠鍵合烷基固定相應用較為普遍，聚合物基質的反相色譜固定相也有較多應用．
反相色譜中樣品的保留值主要由固定相比表面積、鍵合相種類和濃度決定，保留值通常隨鏈長增長或鍵合相的疏水性增強而增大，對於非極性化合物通常遵循以下規則：(弱)非鍵合硅膠 氰基 C1(TMS) C3 C4 苯基 C8 ≈ C18(強)．溶質保留值與固定相表面積成正比，普通載體(80?)的表面積約為250m2/g，而300?孔徑載體的比表面積約為60m2/g。當其他條件相同時，溶質在300?孔徑(低表面積)色譜柱上的保留值大約為80?孔徑色譜柱上保留值的1/4(60：250)，小孔隙柱如高保留的C18柱或石墨碳柱有利於強親水性樣品洗脫．樣品的保留值也可以通過改變流動相組成或溶劑強度來調整，溶劑強度取決於有機溶劑的性質和其在流動相中的濃度．在反相色譜中，採用高溶劑強度、低極性的流動相時可獲得較低保留值．固定相的不同也可以導致選擇性發生變化，氰基、苯基、C8、C18等柱的選擇性有很大差異，一般應優先考慮C8、C18柱，然後是氰基柱，再次是苯基柱．
反相條件下，大多數蛋白質由於低PH、有機溶劑存在、溫度高於室溫和疏水鍵合相等綜合原因發生變性，這些化合物可能以兩種或兩種以上獨立或動態平衡的形式存在，它們通過色譜柱的保留速度不同，導致譜峰展寬、變形、甚至出現單一蛋白有多個峰的現象，部分變性也易使蛋白在柱上聚集，造成被洗脫蛋白的回收率低和鬼峰．反相色譜固定相表面烷基鏈長度對蛋白質的反相保留和蛋白質的活性回收有很大差異，烷基鏈越長(C8、C22、C30)，固定相疏水性越強，為使蛋白質等生物分子洗脫，流動相合機溶劑的含量較高，疏水性過強，會導致生物分子的不可逆吸附和生物活性損失，因此短鏈烷基固定相(C4、C8、苯基等)在生物大分子分離中表現出優勢。對多數小蛋白，在低pH乙腈/水梯度下，用C3~C8色譜柱分離，使蛋白完全展開並避免聚集或沉澱，能夠得到理想的分離結果．
在低pH流動相條件下進行分離，如(0.1% TFA適合於大多數樣品，10~25mmol/L磷酸對疏水性強的蛋白質更有利；以乙腈作有機溶劑，丙醇可能對疏水性強的蛋白質有利；柱溫50~80℃；將樣品溶於6mol/L尿素或鹽酸胍中(只可在室溫)進行預處理；用疏水性更強的鍵合相(長鏈與短鏈烷基鍵合相)；加兩性表面活件劑分離大分子和疏水性強的蛋白質等實驗條件有利於蛋白質樣品完全變性或盡可能降低變性。
色譜法的基本原理
利用樣品混合物中各組分理、化性質的差異，各組分程度不同的分配到互不相溶的兩相中。當兩相相對運動時，各組分在兩相中反復多次重新分配，結果使混合物得到分離。
兩相中，固定不動的一相稱固定相；移動的一相稱流動相。
分類：
根據流動相分—以氣體作流動相—氣相色譜——固定相為液體 氣-液色譜
固定相為固體 氣-固色譜
—以液體作流動相—液相色譜——固定相為液體 液-液色譜
固定相為固體 液-固色譜
—當流動相是在接近它的臨界溫度和壓力下工作的液體時——超臨界色譜
根據固定相的附著方式
—固定相裝在圓柱管中—柱色譜
—固定相塗敷在玻璃或金屬板上—薄膜色譜（平板色譜）
—液體固定相塗在紙上—紙色譜（平板色譜）
根據分離機理
—分配色譜—樣品組分的分配系數不同
—吸附色譜— 樣品組分對固定相表面吸附力不同
—體積排阻色譜—利用固定相孔徑不同，把樣品組分按分子大小分開
—離子交換色譜—不同離子與固定相商相反電荷間的作用力大小不同
根據極性
—流動相極性＞固定相極性-反相色譜
—流動相極性＜固定相極性-正相色譜
氣相色譜只適合分析較易揮發、且化學性質穩定的有機化合物，而HPLC則適合於分析那些用氣相色譜難以分析的物質，如揮發性差、極性強、具有生物活性、熱穩定性差的物質。所以，HPLC的應用范圍已經遠遠超過氣相色譜。
一、吸附色譜（adsorption chromatography）
又叫液固色譜法：流動相是液體，固定相是固體。
分離原理：固定相是固體吸附劑，吸附劑是多孔性微粒物質表面有吸附中心。樣品組分與流動相競爭吸附中 心。各組分的吸附能力不同，使組分在固定相中產生保留時間不同和實現分離。
固定相： 固定相通常是強極性的硅膠、氧化鋁、活性炭、聚乙烯、聚醯胺等固體吸附劑。活性硅膠最常用。
流動相： 弱極性有機溶劑或非極性溶劑與極性溶劑的混合物，如正構烷烴（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲 烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。
應用： 對於極性，結構異構體分離和族分離仍是最有效的方法，如農葯異構體分離、石油中烷、烯、芳烴的 分離。 缺點是容易產生不對稱峰和拖尾現象。
二、分配色譜
原理： 固定液機械的吸附在惰性載體上，樣品分子依據他們在流動相和固定相間的溶解度不同，分別進入兩相分配而實現分離。
固定相：將一種極性或非極性固定液吸附在惰性固相載體上。如全多孔微粒硅膠吸附劑。
根據極性不同分類：正相分配色譜—固定相載體上塗布的是極性固定液；
流動相是非極性溶劑；
可分立極性較強的水溶性樣品；
弱極性組分先洗脫出來。
反相分配色譜—固定相載體上塗布的是非極性或弱極性固定液；
流動相是極性溶劑；
強極性組分先洗脫出來。
液-液分配色譜固定相中的固定液體往往容易溶解到流動相中去，所以重現性很差，且不能進行梯度洗脫，已經不大為人們所採用。
三、鍵合相色譜
考慮分配色譜法中固定液的缺點，因此將各種不同的有機關能團通過化學反應共價結合到固定相惰性載體上，固定相就不會溶解到流動相中去了。
鍵合固定相優點：○ 對極性有機溶劑有良好的化學穩定性
○使色譜柱的柱效高、壽命長
○實驗重現性好
○幾乎適於各種類相的有機化合物的分離，尤其是k』寬范圍的樣品
○可以梯度洗脫
根據極性不同分類：正相鍵合相色譜—固定相極性＞流動相極性
固定相：二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團的有機分子。
適於分離脂榮、水溶性的極性、強極性化合物
反相鍵合相色譜—固定相極性＜流動相極性
固定相：烷基、苯基等非極性有機分子。如最常用的ODS柱或C18柱就 是最典型的代表，其極性很小。
適於分離非機性、弱極性離子型樣品，
是當今液相色譜的最主要分離模式。
正相HPLC（normal phase HPLC）：
是由極性固定相和非極性（或弱極性）流動相所組成的HPLC體系。其代表性的固定相是改性硅膠、氰基柱等，代表性的流動相是正己烷。吸附色譜也屬正相HPLC。
反相HPLC（reversed phase HPLC）：
由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系，與正相HPLC體系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠(ODS柱，Octa Decyltrichloro Silane)，代表性的流動相是甲醇和乙腈。
四、體積排阻色譜（SEC，size exclusion chromatograghy）
（又稱凝膠色譜和分子篩色譜）
原理： 以多孔凝膠（如葡萄糖，瓊脂糖，硅膠，聚丙烯醯胺等）作固定相，依據樣品分子量大小達到分離目 的。大分子不進入凝膠孔洞，沿多孔凝膠膠粒間隙流出，先被洗脫；小分子進入大部分凝膠孔洞， 在柱中被強滯留，後被洗脫。
根據樣品性質分類：凝膠過濾（GFC）—用於分析水溶性樣品，如多肽、蛋白、生物酶、寡聚核苷酸、多聚核 苷酸、多糖。
凝膠滲透（GPC）—用於分析脂溶性樣品，如測定高聚物的分子量。
SEC主要依據分子量大小進行分離，因此與樣品、流動相間的相互作用無關。因此不採用改變流動相的組成來改善分離度。
五、離子交換色譜
（ion exchange chromatography, IEC）
分離原理：使用表面有離子交換基團的離子交換劑作為固定相。帶負電荷的交換基團（如磺酸基和羧酸基）可以用於陽離子的分離；帶正電荷的交換基團（如季胺鹽）可以用於陰離子的分離。不同離子與交換基的作用力大小不同，在樹脂中的保留時間長短不同，從而被相互分離。
Ⅳ 蛋白質復性
問錯地方了。這么專業的生物知識，最好去搜索文獻。關於包涵體的文獻太多了。基本上做蛋白的都有涉及。 不要在這問，自己多下載一些文獻，比這里的回答強的多。
簡單找了點。
1. 對於尿素和鹽酸胍該怎麼選擇?
尿素和鹽酸胍屬中強度變性劑，易經透析和超濾除去。它們對包涵體氫鍵有較強的可逆性變性作用，所需濃度尿素8-10M，鹽酸胍6-8M。尿素溶解包涵體較鹽酸胍慢而弱，溶解度為70-90%，尿素在作用時間較長或溫度較高時會裂解形成氰酸鹽，對重組蛋白質的氨基進行共價修飾，但用尿素溶解具有不電離，呈中性，成本低，蛋白質復性後除去不會造成大量蛋白質沉澱以及溶解的包涵體可選用多種色譜法純化等優點，故目前已被廣泛採用。
鹽酸胍溶解能力達95%以上，且溶解作用快而不造成重組蛋白質的共價修飾。但它也有成本高、在酸性條件下易產生沉澱、復性後除去可能造成大量蛋白質沉澱和對蛋白質離子交換色譜有干擾等缺點。
2. 怎樣洗滌包涵體？
通常的洗滌方法一般是洗不幹凈的，可以先把包涵體用6M鹽酸胍溶解充分，過濾除去未溶解的物質，注意留樣跑電泳，然後用水稀釋到4M,離心把沉澱和上清分別跑電泳，如此類推可以一直稀釋到合適的濃度，可以找到一個合適去除雜質的辦法，其實這就是梯度沉澱的方法，比通常的直接洗脫效果好。
3. 8M尿素溶解的包涵體溶液應如何保存?
在4度放置半個月，都沒什麼問題 。在室溫放置超過48小時，可能會對目的蛋白有影響，因為尿素在鹼性條件下可使一些氨基酸醯基化，所以早些處理BI溶液比較好。
4. 包涵體復性有什麼原則？
低濃度，平緩梯度，低溫。
5. 復性時的蛋白濃度是？
一般使用濃度為0.1-1mg/ml，太高的濃度容易形成聚體沉澱，太低的濃度不經濟，而且很多蛋白在低濃度時不穩定，很容易變性。
6. 復性中蛋白析出是怎麼回事？該怎麼處理？
出現蛋白析出，肯定是條件變化太劇烈了。復性應該採取復性液濃度和PH值逐漸變化的方法，例如根據包涵體的溶液成分，每隔1個PH或濃度值配置一種溶液，逐步透析到正常。此外透析時必須濃度極低，條件溫和，使蛋白質能夠正確折疊。但是復性的比率應該很低。
若加變性劑尿素可加到2M，鹽酸胍可加到1-1.5M；
另外可將甘油濃度增加，范圍可在≤30%，且在復性樣品中也可加適量甘油。
Ⅵ 磺酸基陽離子交換柱的磺酸基陽離子交換柱產品
Venusil SCX HPLC Columns強陽離來子交源換柱
粒徑5um 孔徑300A 比表面積50m2/g
強陽離子交換柱：以超純硅膠為基質，表面鍵合有芳香族磺酸基團。300A，5um；比表面積50m2/g。可用於分離鹼性、水溶性化合物和生物分子。中國葯典2005版中，鹽酸二甲雙胍的有關物質測定方法即使用磺酸基陽離子交換（SCX）色譜柱。
Venusil SCX HPLC Columns 4.6*100mm/5um
Venusil SCX HPLC Columns 4.6*150mm/5um
Venusil SCX HPLC Columns 4.6*250mm/5um
三聚氰胺VSc 958505-m Venusil scx4.6*250mm/5um
（建議配保護柱卡套使用壽命更長）
Ⅶ 包涵體染色的方法有哪些原理是什麼
包涵體染色的方法有哪些？原理是什麼
包涵體染色的方法有哪些？原理是什麼
包涵體染色的方法有哪些？原理是什麼
蛋白包涵體-溶解原理及方法2009年03月15日；維持包涵體內蛋白質結構的作用力是分子內的作用力，；1.遵循標准；包涵體蛋白質的溶解同樣是一個工藝的關鍵的步驟；(1)快速溶解的動力學；；(2)與蛋白質的結合是可逆的；；(3)對細胞碎片的分離方法沒有干擾作用；；(4)對溫度沒有依賴作用；；(5)抑制蛋白質酶的降解作用；；(6)與蛋白質的氨基沒有化學修飾作用；；
維持包涵體內蛋白質結構的作用力是分子內的作用力，這種作用力也維持天然蛋白質的穩定性的結構。先前有報道這種作用力是共價鍵結合的，但是，現在趨向於一致，就是維持包涵體內部的蛋白質的緊密的結構的是非共價鍵的作用力。二硫鍵，無論是正確的還是錯誤的二硫鍵，在維持內部蛋白質的緊密的結構中都沒有發揮直接的作用。最經常的獲得活性蛋白質的第一步是溶解這些包涵體蛋白質，溶解液是使這些包涵體蛋白質完全變性的成分，當蛋白質被溶解以後，則進入到蛋白質的體外折疊的過程。
1. 遵循標准
包涵體蛋白質的溶解同樣是一個工藝的關鍵的步驟。溶劑的選擇會影響後續的操作、最終的各種蛋白質的收率以及最終的成本，必須遵循以下的標准：
(1) 快速溶解的動力學；
(2) 與蛋白質的結合是可逆的；
(3) 對細胞碎片的分離方法沒有干擾作用；
(4) 對溫度沒有依賴作用；
(5) 抑制蛋白質酶的降解作用；
(6) 與蛋白質的氨基沒有化學修飾作用；
(7) 在可能的情況下，選擇最低的溶解濃度和廉價的溶劑，並適於以後的復性方法。
2. 溶解包涵體的試劑
最經常使用溶解包涵體的試劑包括離液劑或者去垢劑。
最經常使用的溶解和制備蛋白質的離子型的離液劑最早於1969年Hatefi等人發展的離子型的去垢劑如SDS是另外一種溶解包涵體蛋白質和膜蛋白質的試劑，但是一般不用來大規模的生產，而是用來定性。除了強酸、強鹼和利用有機溶劑來提取疏水性很強的蛋白質以外，其他的變性方法如非可逆的共價修飾在工業的大規模生產中很少用到。一旦蛋白質被溶解，蛋白質中的巰基很容易快速地氧化並形成共價的聚集體或者分子內錯配的二硫鍵，然後這些蛋白質就不能再進行折疊。為了防止氧化，可以使這些基團或者利用緩沖液中含有低分子量的疏基試劑保持在還原的狀態或形成磺酸鹽或者形成混合的二硫鍵。
（1）去垢劑
去垢劑是一種最經濟的溶解包涵體蛋白質的方法，一個最大的優點是溶解的蛋白質有可能保持全部的生物活性，說明在此條件下保持了蛋白質的四級結構。最重要的是稀釋以後蛋白質的聚集比其它溶劑生成的很
少。陽離子型、陰離子型的和非離子型的去垢劑都可以使用，使用時的濃度一般高於去垢劑的臨界膠束濃度（CMC ），通常是0.5-5%。
SDS僅僅在大量生產牛生長激素、干擾素和白介素-2中用到。SDS由於具有較低的臨界膠束濃度（CMC）而使得結合到蛋白質分子上的SDS比較難於除去。由於N-十二烷肌氨酸它的CMC比SDS高0.4%，也被用來溶解包涵體蛋白質並可用稀釋的方法使蛋白質復性，殘余的去垢劑可以使用陰離子交換色譜或者超濾的方法除去。這種去垢劑是一種比較溫和的去垢劑，可以選擇性地溶解一些包涵體，但是不能溶解完全的變性的蛋白質的聚集體和大腸桿菌的內膜的蛋白質分子。使用去垢劑一個主要的缺點是對以後的純化和復性的步驟的干擾，去垢劑結合到蛋白質上的強度大離子交換色譜復性蛋白質小不同，比較難於除去，並干擾離子交換和疏水相互作用色譜的過程，在變性的濃度時超濾膜會吸附這些變性劑。所以復性後需要盡量洗滌這些去垢劑，也可以使用環狀糊精鏈狀糊精或者環狀澱粉從復性緩沖液中提取去垢劑。
一個不容忽視的問題是去垢劑可以溶解全部的膜蛋白質中的蛋白質酶，這些蛋白質酶的活性在去垢劑的存在的情況下被活化，可能造成溶解和復性過程的收率的降低。蛋白質復性的收率可以通過以下的方法來提高： a) 先期使用可以溶解膜蛋白質但是不溶解包涵體蛋白質的溶劑盡量洗滌包涵體蛋白質；
b) 包涵體的含有的菌體碎片被完全除去；
c) 溶解包涵體的液體中含有蛋白質酶的抑制劑，如EDTA，苯甲基磺醯氟（PMSF ）等 。
（2）離液劑
其它的離液劑也被用來溶解包涵體蛋白質，最主要的溶解包涵體蛋白質的離液劑是鹽酸胍和尿素，這是最經常使用的溶解試劑，一般情況下選擇6-8mo1/L的濃度，蛋白質濃度在1-10mg/mL。
在溶解色氨酸合成酶A的過程，發現陽離子的溶解能力順序是Gdm+ > Li+ > K+ > Na+，陰離子的順序是SCN- > I- > Br- >Cr-。一些離液劑由於它們的溶液比鹽酸胍和尿素有更高的密度和黏度而不適合用於溶解包涵體，因為利用離心和色譜分離起來比較困難。
為了溶解包涵體蛋白質需要的尿素或者鹽酸胍的濃度根據蛋白質的不同而不同。如果蛋白質天然形態需要溶解的變性劑的濃度不能獲得，則在溶解包涵體時需要首先確定離液劑的濃度。
鹽酸胍由於比較貴，所以一般用來溶解一些附加值比較高的葯物蛋白質分子，選擇鹽酸胍作為溶解試劑，是因為鹽酸胍是一種比脲更為強烈的變性劑，甚至可以溶解脲所不能溶解的包涵體；尿素，由於可能被自發的形成的氰酸鹽或者已有的氰酸鹽的污染，特別是在鹼性環境中，從而造成蛋白質的自由的氨基被不可逆的修飾。消除此種影響的方法是用陰離子的緩沖系統如Tris-HCl溶解脲或者脲在使用之前利用陰離子交換色譜純化，並且配製的溶解和復性的緩沖液在當天使用。脲溶液中影響蛋白質變性的因素與鹽酸胍的不同。溶在脲中的蛋白質受到pH和離子強度的影響，從而影響電荷的蛋白質殘基之間的電荷作用，但是由於鹽酸胍含有高濃度的離子強度，所以這兩個因素的影響很少。
（3）混合溶劑
一般情況下去垢劑並不聯合使用，Lilly等人發現去垢劑和尿素的混合液有效的摩爾濃度較低。尿素和去垢
劑型的鹽混合可以使蛋白質變性，但是尿素和非去垢劑的鹽如氯化鈉反而降低包涵體蛋白質的溶解性，所以要避免使用。
去垢劑結合其他的試劑或者溶解增強劑也被使用，發現尿素和乙酸，尿素和二甲亞楓，尿素和高pH等是比較有效的溶解包涵體蛋白質的方法。
高壓（1-2kbar）、超聲也可以溶解包涵體蛋白質，此時使用的溶解試劑濃度可以比較低，便於後續的復性步驟。
3. 極端pH
酸鹼度也是比較廉價的有效的溶解包涵體的方法。最經常使用酸的是有機酸，濃度在5-80%之間。Gavif和Better使用低的（pH≤2.6）和高溫（85℃ ）溶解抗真菌的重組蛋白質的膚段，低溫和高PH需要溶解時間要長。Reddy和合作者也使用20%乙酸溶解一種麥芽糖結合的蛋白質。但是，同樣的一些不可逆的修飾作用或者酸降解會在極端pH下發生，所以此種方法並不是經常使用的溶解包涵體的方法。
高pH（≥12）也被用來溶解生長激素和原胰島素。在高pH下一些蛋白質同樣可能發生非可逆的變性，原因在於半胱氨酸在鹼性條件下的脫硫過程。所以這種方法盡管比較簡單、廉價，同樣僅僅用於一些特定的蛋白質，特別對於葯用蛋白質一般不採用這種方法。
再登陸http://www.biox.cn/content/20050415/10541.htm
摘要 基因重組蛋白在大腸桿菌中表達時，由於表達量高，往往形成無生物活性的包涵體。包涵體必須經過變性和復性的過程才能獲得有活性的重組蛋白。如何提高基因重組蛋白質的復性率，是生物工程技術的一個研究熱點。對近年來的重組蛋白質的復性方法做一評述，為研究蛋白質折疊以及復性技術的進一步應用提供依據。
關鍵詞 重組蛋白 包涵體 復性 二硫鍵
到目前為止，人們表達的重組蛋白質已有4000多種，其中用E.coli表達的蛋白質要佔90%以上，盡管基因重組技術為大規模生產目標蛋白質提供了嶄新的途徑，然而人們在分離純化時卻遇到了意想不到的困難，即這些蛋白質在E.coli中絕大多數是以包涵體形式存在，重組蛋白不僅不能分泌到細胞外，反而在細胞內聚集成沒有生物活性的直徑約0.1~3.0μm的固體顆粒[1]。自從應用大腸桿菌體系表達基因工程產品以來，人們就一直期望得到高活性、高產量的重組蛋白。不可溶、無生物活性的包涵體必須經過變性、復性才能獲得天然結構以及生物活性，因此應該選擇一個合適的復性過程來實現蛋白質的正確折疊，獲得生物活性，近年來的研究可以使復雜的疏水蛋白、多結構域蛋白、寡聚蛋白、含二硫鍵蛋白在體外成功復性。
包涵體形成的原因
重組蛋白在宿主系統中高水平表達時，無論是原核表達體系或真核表達體系甚至高等真核表達體系，都會形成包涵體[2]。主要因為在重組蛋白的表達過程中，缺乏某些蛋白質折疊過程中需要的酶和輔助因子，或環境不適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的[3]。
1、 表達量過高，研究發現在低表達時很少形成包涵體，表達量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至於沒有足夠的時間進行折疊，二硫鍵不能正確配對，過多的蛋白間的非特異性結合，蛋白質無法達到足夠的溶解度等。
2、 重組蛋白的氨基酸組成，一般說來含硫氨基酸越多越容易形成包涵體。
3、 重組蛋白所處的環境：發酵溫度高或胞內pH接近蛋白的等電點時容易形成包涵體。
4、 重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由於缺少真核生物中翻譯後修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉澱。
5、 有報道認為，豐富的培養基有利於活性蛋白質的表達，當培養條件不佳時，容易形成包涵體。
減少包涵體形成的策略
1、 降低重組菌的生長溫度，降低培養溫度是減少包涵體形成的最常用的方法，較低的生長溫度降低了無活性聚集體形成的速率和疏水相互作用，從而可減少包涵體的形成[4]。
2、 添加可促進重組蛋白質可溶性表達的生長添加劑，培養E.coli時添加高濃度的多醇類、蔗糖或非代謝糖可以阻止分泌到周質的蛋白質聚集反應，在最適濃度范圍內添加這些添加劑不會影響細胞的生長、蛋白質的合成或運輸，其它促重組蛋白質可溶性表達的生長添加劑還有乙醇（誘導熱休克蛋白的表達）、低分子量的巰基或二硫化合物（影響細胞周質的還原態，從而影響二硫鍵的形成）和NaCl[5]。
3、 供給豐富的培養基，創造最佳培養條件，如供氧、pH等。
包涵體的分離及溶解
對於生物制葯工業來說，包涵體的形成也是有利的，不僅可獲得高表達、高純度的重組蛋白質，還可避免細胞水解酶對重組蛋白質的破壞。由於包涵體是蛋白質聚集而成的緻密顆粒，分離的第一步是對培養收集的細胞進行破碎，比較有效的方法是高壓勻漿結合溶菌酶處理，然後5000~20000g離心，可使大部分包涵體沉澱，與可溶性蛋白分離，接著，包涵體沉澱需用去污劑（Triton X-100或脫氧膽酸鈉）和低濃度變性劑（2mol/L尿素或鹽酸胍等）洗滌除去脂類和膜蛋白，這一步很重要，否則會導致包涵體溶解和復性的過程中重組蛋白質的降解[6、7、8]。
包涵體的溶解必須用很強的變性劑，如8mol/L尿素、6~8mol/L鹽酸胍，通過離子間的相互作用破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果稍差，異氰鹽酸胍最強；去污劑，如SDS[7]，可以破壞蛋白內的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白，但由於無法徹底去除而不允許用在制葯行業中；酸，如70%甲酸[9]，可以破壞蛋白的次級鍵從而增溶蛋白，這種方法只適合少數蛋白質。對於含有半胱氨酸的蛋白，在增溶時應加入還原劑（如DTT、GSH、β-ME）打開蛋白質中所有二硫鍵，對於目標蛋白沒有二硫鍵的有時也應使用還原劑，為含二硫鍵的雜蛋白會影響包涵體的溶解，同時還應加入金屬螯合劑，如EDTA或EGTA，用來螯合Cu2+、Fe3+等金屬離子與還原狀態的巰基發生氧化反應[10]。
蛋白質的折疊機理
包涵體蛋白在變性劑作用下，為可溶性伸展態，在變性劑去除或濃度降低時，就會自發的從變性的熱不穩
狀態向熱力學穩定狀態轉變，形成具有生物活性的天然結構[11]。然而在去除變性劑的同時，重組蛋白質在體外折疊，分子間存在大量錯誤折疊和聚合，復性效率往往很低，包涵體蛋白折疊復性的效率實際上取決於正確折疊過程與聚集過程之間的競爭[1]。對於蛋白質的折疊機制，目前有多種不同的假設，但很多學者認為有一個「熔球態」的中間狀態，在「熔球態」中，蛋白質的二級結構已經基本形成，其空間結構也初具規模，再做一些局部調整就可形成正確的立體結構，總之，蛋白質的具體步驟可用下式描述[12、13、14]：
伸展態→中間體→後期中間體→天然態體→聚集體
在折疊反應中，從伸展態到中間體的速度是非常快的，只需要幾毫秒，但從中間體轉變為天然態的過程比較緩慢，是一個限速過程。聚集過程與復性過程相互競爭，故而應盡量避免聚集體的產生。一般認為，蛋白質在復性過程中涉及兩種疏水作用，一是分子內的疏水相互作用，可促進蛋白質正確折疊；一是部分折疊的肽鏈分子間的疏水相互作用，在復性過程中，部分折疊的中間體的疏水簇外露，分子間的疏水相互作用會導致蛋白質聚集。蛋白質的立體結構雖然由其氨基酸的順序決定，然而伸展肽鏈折疊為天然活性結構的過程還受到周圍環境的影響，如溫度、pH值、離子強度、復性時間等因素的影響。
提高重組蛋白質折疊復性的方法
一個有效的、理想的折疊復性方法應具備以下幾個特點：活性蛋白質的回收率高；正確復性的產物易於與錯誤折疊蛋白質分離；折疊復性後應得到濃度較高的蛋白質產品；折疊復性方法易於放大；復性過程耗時較少[15]。
1、 透析、稀釋和超濾復性法：這三種方法是最傳統也是應用最普遍的蛋白質折疊復性方法，復性活性回收率低，而且難於與雜蛋白分離。透析法耗時長，易形成無活性蛋白質聚集體；超濾法在膜上聚集變性，易造成膜污染；稀釋法處理量太大，不利於工業放大[16]。
2、 高蛋白濃度下的復性方法：一個成功的復性過程在於能夠在高蛋白濃度下仍能得到較高的復性率。一個方法是把變性蛋白緩慢連續或不連續地加入到復性液中[17]。在兩次蛋白加入之間，應有足夠的時間間隔使蛋白質折疊通過了易聚集的中間體階段。這是由於完全折疊的蛋白通常不會與正在折疊的蛋白一起聚集。第二種方法是用溫度跳躍策略[4]。變性蛋白在低溫下復性折疊以減少聚集，直到易聚集的中間體大都轉化為不易聚集的後期中間體後，溫度快速升高來促進後期中間體快速折疊為蛋白的天然構象。第三種方法是復性在中等的變性劑濃度下進行[18]，變性劑濃度應高到足以有效防止聚集，同時又必須低到能夠引發正確復性。
3、 添加促進劑的復性方法：包涵體蛋白質折疊復性促進劑的促進作用可以分為：穩定正確折疊蛋白質的天然結構、改變錯誤折疊蛋白質的穩定性、增加折疊復性中間體的溶解性、增加非折疊蛋白質的溶解性。通常使用的添加劑有：a、共溶劑：如PEG6000~20000，通過與中間體特異的形成非聚集的復合物，可以阻止蛋白質分子間的相互碰撞機會，減少蛋白質的聚集；b、去污劑及表面活性劑：如Trition X-100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜鹼等對蛋白質復性有促進作用，但它們能與蛋白質結合，很難去除；c、氧化-還原劑：對於含有二硫鍵的蛋白，復性過程中應加入氧化還原體系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等，氧化還原系統通過促進不正確形成的二硫鍵快速交換反應，提高了正確配對的二硫鍵的產率[19]；d、小分子的添加劑：如鹽酸胍或尿素、烷基脲、碳酸醯胺類等，都可阻止蛋白聚集，它們的作用可能為：穩定蛋白的活性狀態、降低非正確折疊的穩定性、增加折疊中間體的穩定性、增加解折疊狀態的穩定性。e、0.4~0.6M L-Arg：L-Arg能使得不正確折疊的蛋白質結構以及不正確連接的二硫鍵變得不穩定，使折疊向正確方向進行，可大幅度地提高包涵體蛋白質的折疊效率。f、添加分子伴侶和折疊酶：分子伴侶是指能夠結合和穩定
Ⅷ 蛋白透析復性後，調pH變渾濁，蛋白會有影響嗎
問錯地方了。這么專業的生物知識，最好去搜索文獻。關於包涵體的文獻太多了。基本上做蛋白的都有涉及。 不要在這問，自己多一些文獻，比這里的回答強的多。
簡單找了點。
對於尿素和鹽酸胍該怎麼選擇?
尿素和鹽酸胍屬中強度變性劑，易經透析和超濾除去。它們對包涵體氫鍵有較強的可逆性變性作用，所需濃度尿素8-10M，鹽酸胍6-8M。尿素溶解包涵體較鹽酸胍慢而弱，溶解度為70-90%，尿素在作用時間較長或溫度較高時會裂解形成氰酸鹽，對重組蛋白質的氨基進行共價修飾，但用尿素溶解具有不電離，呈中性，成本低，蛋白質復性後除去不會造成大量蛋白質沉澱以及溶解的包涵體可選用多種色譜法純化等優點，故目前已被廣泛採用。
鹽酸胍溶解能力達95%以上，且溶解作用快而不造成重組蛋白質的共價修飾。但它也有成本高、在酸性條件下易產生沉澱、復性後除去可能造成大量蛋白質沉澱和對蛋白質離子交換色譜有干擾等缺點。
2. 怎樣洗滌包涵體？
通常的洗滌方法一般是洗不幹凈的，可以先把包涵體用6M鹽酸胍溶解充分，過濾除去未溶解的物質，注意留樣跑電泳，然後用水稀釋到4M,離心把沉澱和上清分別跑電泳，如此類推可以一直稀釋到合適的濃度，可以找到一個合適去除雜質的辦法，其實這就是梯度沉澱的方法，比通常的直接洗脫效果好。
3. 8M尿素溶解的包涵體溶液應如何保存?
在4度放置半個月，都沒什麼問題 。在室溫放置超過48小時，可能會對目的蛋白有影響，因為尿素在鹼性條件下可使一些氨基酸醯基化，所以早些處理BI溶液比較好。
4. 包涵體復性有什麼原則？
低濃度，平緩梯度，低溫。
5. 復性時的蛋白濃度是？
一般使用濃度為0.1-1mg/ml，太高的濃度容易形成聚體沉澱，太低的濃度不經濟，而且很多蛋白在低濃度時不穩定，很容易變性。
6. 復性中蛋白析出是怎麼回事？該怎麼處理？
出現蛋白析出，肯定是條件變化太劇烈了。復性應該採取復性液濃度和PH值逐漸變化的方法，例如根據包涵體的溶液成分，每隔1個PH或濃度值配置一種溶液，逐步透析到正常。此外透析時必須濃度極低，條件溫和，使蛋白質能夠正確折疊。但是復性的比率應該很低。
若加變性劑尿素可加到2M，鹽酸胍可加到1-1.5M；
另外可將甘油濃度增加，范圍可在≤30%，且在復性樣品中也可加適量甘油。
Ⅸ 有四種蛋白質溶液，其大小和等電點分別是54kD和4，48kD和7，100kD和4，75kD和10 ，請設計實驗
（1）100kD蛋白的純化可以分為兩步：離子交換和分子篩。因為48kD和75kD的蛋白等電點與目的蛋白相差很大，所以在相同的buffer條件下，前兩者帶點性質與目的蛋白相差很大，通過離子交換的方法可以將三者分開。具體來說可以選用pH5.5左右的buffer，用Q柱純化。54kD的蛋白和100kD的蛋白電荷性質類似，通過離子交換層析可能分不開，但二者分子量有近兩倍的差距，適用於分子篩，所以第二步選用合適的分子篩利用二者分子量的大小分開即可。
（2）6M鹽酸胍處理之後除了肽鍵和二硫鍵無法打開之外，蛋白完全變性。這種條件下測得的分子量是25kD，加入beta-ME之後二硫鍵被還原打開，測得分子量為10kD和15kD，說明這二者是通過二硫鍵相連的，所以結構為一個10kD和一個15kD的亞基通過分子間二硫鍵的作用連成二聚體。也有可能是異源四聚體，異源六聚體，異源八聚體等等。因為第一步測定的分子量是在鹽酸胍條件下，多聚體之間如果沒有二硫鍵連接也會被解聚。如下圖：