偶聯DNA超濾管
① 基因表達調控的主要要素
緒
論
一、問答
1．什麼是生物化學？它主要研究哪些內容？
2．生物化學經歷了哪幾個發展階段？各個時期研究的主要內容是什麼？試舉各
時期一二例重大成就。
第一章
蛋白質結構與功能
一、問答題
1．蛋白質在生命活動中有何重要意義？
2．蛋白質是由哪些元素組成的？其基本結構單元是什麼？寫出其結構通式。
3．蛋白質中有哪些常見的氨基酸？寫出其中文名稱和三字縮寫符號，它們的側鏈基團各有何特點？寫出這些氨基酸的結構式。
4．組成蛋白質的氨基酸分幾類？分類的依據是什麼？
5．簡述其結構特點和生物學作用？
6．蛋白質的空間結構分幾個層次？各有何結構特點。
8．簡述蛋白質的
a
-螺旋的結構特點。
9．何為蛋白質變性？變性在醫學中的應用
10．簡述蛋白質變性與變構的異同。
11．試述蛋白質結構與功能的關系。
12．如何利用蛋白的理化性質對蛋白質進行分離純化？
二、解釋下列名稱
1.肽單元
2.變構效應
3.無規則捲曲
4.
a
-螺旋
5.
β
-折疊
6.
β
-轉角
7.鹽析
8.分段鹽析
9.透析
10.超濾
11.氨基酸的等電點(
pI
)
12.模序
13.結構域
14.肽鍵
15．亞基
第二章
核酸結構與功能
一、問答題
1.
核酸徹底水解後可得到哪些成分？DNA與RNA的水解產物有何不同？
2.
比較
DNA和RNA的異同。
3.
DNA雙螺旋結構要點。
4.
RNA
的分類及功能。
5.
比較原核生物和真核生物
mRNA一級結構的區別。
二、解釋下列名詞
1.增色效應與減色效應
2.DNA的變性與復性
3.核小體
4.DNA變性
5.熔解溫度
6.核酸雜交
第三章
酶
一、問答題
1.
什麼是酶？其化學本質是什麼？
2.
酶作為生物催化劑具有什麼特點？
3.
何為酶促反應動力學？影響酶促反應的因素有哪些？
4.
舉例說明酶的特異性
5.
試說明酶變構調節的機制及生物學意義？
6.
何為同工酶及同工酶的生物學意義？
7.
試比較三種可逆性抑制的特點
8.
測定酶活力時應注意哪些問題？
二、解釋下列名詞
1.多酶復合體和多功能酶
2.全酶和輔助因子
3.輔基和輔酶
4.酶的活性中心
5.酶原
6.同工酶7.變構酶
8.酶活力
9.酶活力單位
10.比活力
11.米氏常數
第四章
糖代謝
一、問答題
1．試比較糖酵解與有氧氧化不同點。
2．試述丙氨酸異生為葡萄糖的主要反應過程及其酶。
3．試述乳酸異生為葡萄糖的主要反應過程及其酶。
4．簡述6-磷酸葡萄糖的代謝去路。
5．簡述B族維生素在糖代謝中的作用。
6．為什麼肌糖原不能直接補充血糖？
② 如何防止DNA電泳拖尾
PCR擴增有時出現塗抹帶或片狀帶或地毯樣帶。
其原因往往由於酶量過多或酶的質量差或酶的專一性不夠，DNA模板量過大，dNTP濃度過高，Mg2 濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多，模板長於3kd所引起。
減少酶量（一般以2單位Taq DNA聚合酶為基點，分梯度上下調一調，其他酶也差不多如此濃度，可以參考說明書）；加強DNA聚合酶的專一性或調換另一來源的專一性更好的DNA聚合酶。
增加DNA聚合酶的專一性。
（1）改用專一性更強的DNA聚合酶，或者使用兩種不同的DNA聚合酶，減低酶量或調換另一來源的專一性高的酶。更換DNA聚合酶時，酶量不要太大，以免出現特異性擴增。 （2）酶制劑中的甘油可能也是干擾因素。可以加入反應體系之前用超濾去除酶制劑中的甘油，若此操作引起酶的濃度過高，可以適當加雙蒸餾水稀釋。
（3）為了加強Taq DNA聚合酶的專一性。 的專一性，可在反應體系中加入：1-1.5mol/L的甜菜鹼或者5%的DMSO可以提高PCR擴增效率，兩者可以增加Taq DNA聚合酶的穩定性。
適當減少dNTP的濃度；減少dNTP的濃度一般需要與降低Mg2 濃度同方向偶聯進行，但是不必按同樣的比例。
適當降低Mg2 濃 度，可以採用梯度遞減方式，以每次0.5mol/L遞減，但是Mg2 的終濃度不要低於1.0mol/L。
縮短PCR反應的退火溫度時間或調高復性溫度。沒有重新設計引物之前，不要大范圍地變動反應體系的復性溫度，要在引物的Tm少5-10度的范圍內變動。如果出現非特異性擴增，則在引物的Tm少5-10度的范圍內把PCR反應的復性溫度提高1-3度。
使用梯度降低PCR。在以基因組DNA為模板進行PCR擴增時，非特異性擴增較多，這時，最初的退火溫度選用比Tm高5-10度。然後每隔1個循環，退火溫度降低1-2度，直至到達正常的Tm附近的退火溫度。
採用使用專一性更強的梯度降低PCR、熱啟動PCR和巢式PCR。使用熱啟動模式。使用熱啟動時可以購買商用的PCR熱啟動酶，也可以用石蠟隔離模式。巢式PCR也有現成的試劑盒可以購買。
保證PCR反應的DNA模板的質量，要用電泳檢測一下分子量和純度，質量不好則要重新提取和純化DNA模板；適當增加DNA模板量，減少循環次數。
以上措施都不行時，最後就只能重新設計引物，加強引物的專一性。
適當減少DNA模板量。
適當減少循環次數，一般也就循環25次就差不多了。
③ 耐熱菌的基因克隆
一、酶的概念
生物體內的新陳代謝過程包含著許多復雜而有規律的物質代謝和能量變化。綠色植物和某些細菌利用太陽光能、水、CO2和無機鹽等簡單物質，經過一系列變化，合成復雜的糖、脂、蛋白質等大分子物質，而動物又利用植物中的這些物質，並經過錯綜復雜的分解和合成、反應轉化為自身所需要的一部分，使自己得以生長、繁殖等等。在實驗室中，復雜有機物的合成與分解必須要在高溫、高壓、強酸強鹼等劇烈條件下才能進行，如澱粉和蛋白質的水解；而有些反應則在體外難以進行，如蛋白質的合成。但是在生物體內雖然條件十分溫和（370C左右、近中性pH值），這些反應卻能順利和快速的進行。例如，動物吃下的肉食在消化道內只需要幾個小時便被完全消化分解；細菌在合適的條件下，二十分鍾就增殖一代，在這短短的二十分鍾內，合成了新細胞內所需要的全部的各種復雜的物質等等，這是什麽原因呢？這種使體內化學反應變得容易和迅速進行的根本原因就是生物體內普遍存在一種起催化作用的蛋白質--酶。
酶(enzyme)是活細胞內產生的具有高度專一性和催化效率的蛋白質，又稱為生物催化劑。酶是生物體自身產生的，在新陳代謝過程中，幾乎所有的化學反應都是在酶的催化下進行的，且條件溫和，反應效率極高，使生物體內各種物質處於不斷的新陳代謝中，從這個意義上講，沒有酶就沒有生命。細胞內合成的酶主要是在細胞內起催化作用，也有些酶合成後釋入血液或消化道，並在那裡發揮其催化作用，人工提取的酶在合適的條件下也可在試管中對其特殊底物起催化作用。
二、酶的研究歷史：酶學知識最初來源於生產生活實踐（如發酵和釀造）和對疾病的治療等。從有記載的史料中看，我國4千多年前的夏禹時代就盛行釀酒；周朝已開始制醋、醬、豆豉（在黴菌蛋白酶作用下產生的風味食品）飴糖（主要含麥芽糖），並用麴來治療消化不良，直到現在仍是常見的健胃葯。酶的系統研究起始於19世紀中葉對發酵本質的研究。Pasteur提出，發酵離不了酵母細胞。
國外知道酶的存在是和發酵聯系在一起的。1833年，Payen從麥芽的抽提物中沉澱出一種對熱不穩定的物質，它可促進澱粉水解成可溶性糖，人們開始意識到生物細胞中可能存在著一種類似催化劑的物質。1896年，W·Kuhne首先把這類物質稱為"enzyme"，中文譯為"酶"。1897年Buchner成功地用不含細胞的酵母液實現發酵，說明具有發酵作用的物質存在於細胞內，並不依賴活細胞。1926年Sumner首次提取出脲酶，並進行結晶，提出酶的本質是蛋白質，並幾乎要參與所有的生命活動過程。
1982年以後陸續發現某些RNA和DNA也具有酶的催化功能，使人們進一步認識到，酶不都是蛋白質。現代科學認為，酶是由活細胞產生的，能在體內或體外起同樣催化作用的一類具有活性中心和特殊構象的生物大分子，包括蛋白質和核酸。酶是一切生命活動的序幕，是機體內一切化學變化的激動者。本章只討論蛋白質屬性的酶。
現已有二千餘種酶被鑒定出來，其中有二百餘種得到結晶，特別是近幾十年來，隨著蛋白質分離技術的進步，酶的分子結構、酶作用機理的研究得到發展，有些酶的結構和作用機理已被闡明。總之，隨著酶學理論不斷深入，必將對揭示生命本質研究作出更大的貢獻。