層析過濾器

❶ 為什麼凝膠過濾層析柱會漏水

凝膠過濾層析(gel filtration chromatography)
凝膠過濾層析法又稱排阻層析或分子篩方法，主要是根據蛋白質的大小和形狀，即蛋白質的質量進行分離和純化。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網狀結構物質，多是交聯的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類物質，使蛋白質混合物中的物質按分子大小的不同進行分離。
也叫做分子排阻層析（molecular-exclusion chromatography）。一種利用帶孔凝膠珠作基質，按照分子大小分離蛋白質或其它分子混合物的層析技術。 一般是大分子先流出來，小分子後流出來。
凝膠過濾層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用具有網狀結構的凝膠的分子篩作用，根據被分離物質的分子大小不同來進行分離。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網狀結構物質，多是交聯的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類物質，小分子物質能進入其內部，流下來速度慢，而大分子物質卻被排除在外部，下來的速度快，當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質就按不同分子量篩分開了。
它的突出優點是層析所用的凝膠屬於惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當廣的溫度范圍下進行，不需要有機溶劑，並且對分離成分理化性質的保持有獨到之處。對於高分子物質有很好的分離效果。
⒈凝膠的選擇根據實驗目的不同選擇不同型號的凝膠。如果實驗目的是將樣品中的大分子物質和小分子物質分開，由於它們在分配系數上有顯著差異，這種分離又稱組別分離，一般可選用SephadexG-25和G-50，對於小肽和低分子量的物質（1000-5000）的脫鹽可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果實驗目的是將樣品中一些分子量比較近似的物質進行分離，這種分離又叫分級分離。一般選用排阻限度略大於樣品中最高分子量物質的凝膠，層析過程中這些物質都能不同程度地深入到凝膠內部，由於Kd不同，最後得到分離。
⒉柱的直徑與長度根據經驗，組別分離時，大多採用2-30cm長的層析柱，分級分離時，一般需要100cm左右長的層析柱，其直徑在1-5cm范圍內，小於1cm產生管壁效應，大於5cm則稀釋現象嚴重。長度L與直徑D的比值L/D一般宜在7-10之間，但對移動慢的物質宜在30-40之間。
⒊凝膠柱的制備凝膠型號選定後，將干膠顆粒懸浮於5-10倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之後將極細的小顆粒傾瀉出去。自然溶脹費時較長，加熱可使溶脹加速，即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫至近沸，1-2小時即可達到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節省時間又可消毒。
凝膠的裝填：將層析柱與地面垂直固定在架子上，下端流出口用夾子夾緊，柱頂可安裝一個帶有攪拌裝置的較大容器，柱內充滿洗脫液，將凝膠調成較稀薄的漿頭液盛於柱頂的容器中，然後在微微地攪拌下使凝膠下沉於柱內，這樣凝膠粒水平上升，直到所需高度為止，拆除柱頂裝置，用相應的濾紙片輕輕蓋在凝膠床表面。稍放置一段時間，再開始流動平衡，流速應低於層析時所需的流速。在平衡過程中逐漸增加到層析的流速，千萬不能超過最終流速。平衡凝膠床過夜，使用前要檢查層析床是否均勻，有無「紋路」或氣泡，或加一些有色物質來觀察色帶的移動，如帶狹窄、均勻平整說明層析柱的性能良好，色帶出現歪曲、散亂、變寬時必須重新裝柱。
⒋加樣和洗脫凝膠床經過平衡後，在床頂部留下數亳升洗脫液使凝膠床飽和，再用滴管加入樣品。一般樣品體積不大於凝膠總床體積的5％-10％。樣品濃度與分配系數無關，故樣品濃度可以提高，但分子量較大的物質，溶液的粘度將隨濃度增加而增大，使分子運動受限，故樣品與洗脫液的相對粘度不得超過1.5-2.樣品加入後打開流出口，使樣品滲入凝膠床內，當樣品液面恰與凝膠床表面相平時，再加入數毫升洗脫液中洗管壁，使其全部進入凝膠床後，將層析床與洗脫液貯瓶及收集器相連，預先設計好流速，然後分部收集洗脫液，並對每一餾份做定性、定量測定。
⒌凝膠柱的重復使用、凝膠回收與保存一次裝柱後可以反復使用，不必特殊處理，並不影響分離效果。為了防止凝膠染菌，可在一次層析後加入0.02％的疊氮鈉，在下次層析前應將抑菌劑除去，以免干擾洗脫液的測定。
如果不再使用可將其回收，一般方法是將凝膠用水沖洗干凈濾干，依次用70％、90％、95％乙醇脫水平衡至乙醇濃度達90％以上，濾干，再用乙醚洗去乙醇、濾干、乾燥保存。濕態保存方法是凝膠漿中加入抑菌劑或水沖洗到中性，密封後高壓滅菌保存。
⒍凝膠層析的應用
⑴脫鹽：高分子（如蛋白質、核酸、多糖等）溶液中的低分子量雜質，可以用凝膠層析法除去，這一操作稱為脫鹽。本法脫鹽操作簡便、快速、蛋白質和酶類等在脫鹽過程中不易變性。適用的凝膠為SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱長與直徑之比為5-15，樣品體積可達柱床體積的25％-30％，為了防止蛋白質脫鹽後溶解度降低會形成沉澱吸附於柱上，一般用醋酸銨等揮發性鹽類緩沖液使層析柱平衡，然後加入樣品，再用同樣緩沖液洗脫，收集的洗脫液用冷凍乾燥法除去揮發性鹽類。
⑵用於分離提純：凝膠層析法已廣泛用於酶、蛋白質、氨基酸、多糖、激素、生物鹼等物質的分離提純。凝膠對熱原有較強的吸附力，可用來去除無離子水中的致熱原制備注射用水。
⑶測定高分子物質的分子量：用一系列已知分子量的標准品放入同一凝膠柱內，在同一條件下層析，記錄每一分鍾成分的洗脫體積，並以洗脫體積對分子量的對數作圖，在一定分子量范圍內可得一直線，即分子量的標准曲線。測定未知物質的分子量時，可將此樣品加在測定了標准曲線的凝膠柱內洗腫後，根據物質的洗脫體積，在標准曲線上查出它的的分子量。
⑷高分子溶液的濃縮：通常將SephadexG-25或50干膠投入到稀的高分子溶液中，這時水分和低分子量的物質就會進入凝膠粒子內部的孔隙中，而高分子物質則排阻在凝膠顆粒之外，再經離心或過濾，將溶脹的凝膠分離出去，就得到了濃縮的高分子溶液

❷ SDS-PAGE和分子篩過濾層析測定蛋白質分子量在原理和方法上有何不同。

sds分離靠的是在電場中蛋白質分子跟page的結合後的分子量大小從而在凝膠中跑的速度回不同而分開的。

分子篩是根據答不同分子量的分子大小不同,從而進行蛋白質分離,達到測量分子量的目的的。

SDS-PAGE：聚丙烯醯胺凝膠電泳，作用：用於分離蛋白質和寡核苷酸。

作用原理：聚丙烯醯胺凝膠為網狀結構，具有分子篩效應。它有兩種形式：非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳（Native-PAGE）和SDS-聚丙烯醯胺凝膠（SDS-PAGE）；非變性聚丙烯醯胺凝膠，在電泳的過程中，蛋白質能夠保持完整狀態，並依據蛋白質的分子量大小、蛋白質的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。

而SDS-PAGE僅根據蛋白質亞基分子量的不同就可以分開蛋白質。該技術最初由shapiro於1967年建立，他們發現在樣品介質和丙烯醯胺凝膠中加入離子去污劑和強還原劑（SDS即十二烷基硫酸鈉）後，蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決於亞基分子量的大小（可以忽略電荷因素）。

❸ 凝膠過濾層析的基本原理是什麼

凝膠過濾層析又稱為排阻層析或分子篩方法。其基本原理是利用被分離物質分子大小不同及固定相（凝膠）具有分子篩的特點，將被分離物質各成分按分子大小分開，達到分離的目的。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網狀結構物質，多是交聯的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類物質，小分子物質能進入其內部，流下時路程較長，而大分子物質卻被排除在外部，下來的路程短，當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質就按不同分子量篩分開了。

❹ 凝膠過濾層析可根據蛋白質的大小將之分離...

小分子量蛋白質
大分子量蛋白質

❺ 凝膠過濾層析的優點

它的突出優點是層析所用的凝膠屬於惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當廣的溫度范圍下進行，不需要有機溶劑，並且對分離成分理化性質的保持有獨到之處。對於高分子物質有很好的分離效果。

❻ 影響凝膠過濾層析解析度的主要因素有哪些

(1)層析柱的選擇
層析柱大小主要是根據樣品量的多少以及對解析度的要求來進行選擇。一般來講，主要是層析柱的長度對解析度影響較大，長的層析柱解析度要比短的高；但層析柱長度不能過長，否則會引起柱子不均一、流速過慢等實驗上的一些困難。一般柱長度不超過100cm，為得到高解析度，可以將柱子串聯使用。層析柱的直徑和長度比一般在1:25－1:100之間。用於分組分離的凝膠柱，如脫鹽柱由於對解析度要求較低，所以一般比較短。
(2)凝膠柱的鑒定
凝膠柱的填裝情況將直接影響分離效果，關於填裝的方法前面已有介紹，這里主要介紹對填裝好的凝膠柱的鑒定。凝膠柱填裝後用肉眼觀察應均勻、無紋路、無氣泡。另外通常可以採用一種有色的物質，如藍色葡聚糖-2000、血紅蛋白等上柱，觀察有色區帶在柱中的洗脫行為以檢測凝膠柱的均勻程度。如果色帶狹窄、平整、均勻下降，則表明柱中的凝膠填裝情況較好，可以使用；如果色帶彌散、歪曲，則需重新裝柱。另外值得一提的是，有時為了防止新凝膠柱對樣品的吸附，可以用一些物質預先過柱，以消除吸附。
(3)洗脫液的選擇
由於凝膠層析的分離原理是分子篩作用，它不象其它層析分離方式主要依賴於溶劑強度和選擇性的改變來進行分離，在凝膠層析中流動相只是起運載工具的作用，一般不依賴於流動相性質和組成的改變來提高解析度，改變洗脫液的主要目的是為了消除組分與固定相的吸附等相互作用，所以和其它層析方法相比，凝膠層析洗脫液的選擇不那麼嚴格。由於凝膠層析的分離機理簡單以及凝膠穩定工作的pH 范圍較廣，所以洗脫液的選擇主要取決於待分離樣品，一般來說只要能溶解被洗脫物質並不使其變性的緩沖液都可以用於凝膠層析。為了防止凝膠可能有吸附作用，一般洗脫液都含有一定濃度的鹽。
(4)加樣量
關於加樣前面已經有所介紹，要盡量快速、均勻。另外加樣量對實驗結果也可能造成較大的影響，加樣過多，會造成洗脫峰的重疊，影響分離效果；加樣過少，提純後各組分量少、濃度較低，實驗效率低。加樣量的多少要根據具體的實驗要求而定：凝膠柱較大，當然加樣量就可以較大；樣品中各組分分子量差異較大，加樣量也可以較大；一般分級分離時加樣體積約為凝膠柱床體積的1％－5％左右，而分組分離時加樣體積可以較大，一般約為凝膠柱床體積的10％－25％。如果有條件可以首先以較小的加樣量先進行一次分析，根據洗脫峰的情況來選擇合適的加樣量。設要分離的兩個組分的洗脫體積分別為Ve1和Ve2，那麼加樣量不能超過(Ve1－Ve2)。實際由於樣品擴散，所以加樣量應小於這個值。
從洗脫峰上看，如果所要的各個組分的洗脫峰分得很開，為了提高效率，可以適當增加加樣量；如果各個組分的洗脫峰只是剛好分開或沒有完全分開，則不能再加大加樣量，甚至要減小加樣量。另外加樣前要注意，樣品中的不溶物必須在上樣前去掉，以免污染凝膠柱。樣品的粘度不能過大，否則會影響分離效果。
(5)洗脫速度
洗脫速度也會影響凝膠層析的分離效果，一般洗脫速度要恆定而且合適。保持洗脫速度恆定通常有兩種方法，一種是使用恆流泵，另一種是恆壓重力洗脫。洗脫速度取決於很多因素，包括柱長、凝膠種類、顆粒大小等，一般來講，洗脫速度慢一些樣品可以與凝膠基質充分平衡，分離效果好。但洗脫速度過慢會造成樣品擴散加劇、區帶變寬，反而會降低解析度，而且實驗時間會大大延長；所以實驗中應根據實際情況來選擇合適的洗脫速度，可以通過進行預備實驗來選擇洗脫速度。一般凝膠的流速是2－10 cm/hr，市售的凝膠一般會提供一個建議流速，可供參考。總之，凝膠層析的各種條件，包括凝膠類型、層析柱大小、洗脫液、上樣量、洗脫速度等等，都要根據具體的實驗要求來選擇。例如樣品中各個組分差異較小，則實驗要求凝膠層析要有較高的解析度，提高解析度的選擇應主要包括：選擇包括各個待分離組分但分離范圍盡量小一些的凝膠，選擇顆粒小的凝膠，選擇解析度高的凝膠類型，選擇較長、直徑較大的層析柱、減少加樣量、降低洗脫速度等等。

❼ 凝膠過濾層析的使用方法

⒈凝膠的選擇根據實驗目的不同選擇不同型號的凝膠。如果實驗目的是將樣品中的大分子物質和小分子物質分開，由於它們在分配系數上有顯著差異，這種分離又稱組別分離，一般可選用SephadexG-25和G-50，對於小肽和低分子量的物質（1000-5000）的脫鹽可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果實驗目的是將樣品中一些分子量比較近似的物質進行分離，這種分離又叫分級分離。一般選用排阻限度略大於樣品中最高分子量物質的凝膠，層析過程中這些物質都能不同程度地深入到凝膠內部，由於Kd不同，最後得到分離。
⒉柱的直徑與長度根據經驗，組別分離時，大多採用2-30cm長的層析柱，分級分離時，一般需要100cm左右長的層析柱，其直徑在1-5cm范圍內，小於1cm產生管壁效應，大於5cm則稀釋現象嚴重。長度L與直徑D的比值L/D一般宜在7-10之間，但對移動慢的物質宜在30-40之間。
⒊凝膠柱的制備凝膠型號選定後，將干膠顆粒懸浮於5-10倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之後將極細的小顆粒傾瀉出去。自然溶脹費時較長，加熱可使溶脹加速，即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫至近沸，1-2小時即可達到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節省時間又可消毒。
凝膠的裝填：將層析柱與地面垂直固定在架子上，下端流出口用夾子夾緊，柱頂可安裝一個帶有攪拌裝置的較大容器，柱內充滿洗脫液，將凝膠調成較稀薄的漿頭液盛於柱頂的容器中，然後在微微地攪拌下使凝膠下沉於柱內，這樣凝膠粒水平上升，直到所需高度為止，拆除柱頂裝置，用相應的濾紙片輕輕蓋在凝膠床表面。稍放置一段時間，再開始流動平衡，流速應低於層析時所需的流速。在平衡過程中逐漸增加到層析的流速，千萬不能超過最終流速。平衡凝膠床過夜，使用前要檢查層析床是否均勻，有無「紋路」或氣泡，或加一些有色物質來觀察色帶的移動，如帶狹窄、均勻平整說明層析柱的性能良好，色帶出現歪曲、散亂、變寬時必須重新裝柱。
⒋加樣和洗脫凝膠床經過平衡後，在床頂部留下數亳升洗脫液使凝膠床飽和，再用滴管加入樣品。一般樣品體積不大於凝膠總床體積的5%-10%。樣品濃度與分配系數無關，故樣品濃度可以提高，但分子量較大的物質，溶液的粘度將隨濃度增加而增大，使分子運動受限，故樣品與洗脫液的相對粘度不得超過1.5-2.樣品加入後打開流出口，使樣品滲入凝膠床內，當樣品液面恰與凝膠床表面相平時，再加入數毫升洗脫液中洗管壁，使其全部進入凝膠床後，將層析床與洗脫液貯瓶及收集器相連，預先設計好流速，然後分部收集洗脫液，並對每一餾份做定性、定量測定。
⒌凝膠柱的重復使用、凝膠回收與保存一次裝柱後可以反復使用，不必特殊處理，並不影響分離效果。為了防止凝膠染菌，可在一次層析後加入0.02%的疊氮鈉，在下次層析前應將抑菌劑除去，以免干擾洗脫液的測定。

❽ SDS-PAGE和分子篩過濾層析測定蛋白質分子量在原理和方法上有何不同

電泳法分離蛋白質是根據蛋白質的什麼原理：一般是通過生化方法吧蛋白提取出來，蛋白質帶有電荷么，是將混合樣品中的蛋白質，其原理是第一向基於蛋白質PI不同用等電聚焦，電泳時的正極與負極都會發生電解反應，向著與其電性相反的電極移動的現象稱為電泳。是根據蛋白質的電荷不同即酸鹼性質不同分離蛋白質混合物的方法。1、電泳：在外電場的作用下，帶點顆粒將向著與其電性相反的電極移動，這種現象稱為電泳。電泳技術可用於氨基酸、肽、蛋白質和核苷酸等生物分子的分析分離和制備。區帶電泳是由於在支持物上電泳蛋白質混合物被分離為若干區帶。電泳前用緩沖液浸潤薄膜或濾紙等支持物或用緩沖液直接配置成凝膠，將待分離的蛋白質樣品加在它的一端或中央，支持物的兩端與電極連接，通電電泳。電泳完畢，各個組分分布在不同的區域，用顯色劑（蛋白質可用考馬斯亮藍或氨基黑等染色）顯色後可以顯示出各個組分。氨基酸混合物特別是寡聚核苷酸混合物一次電泳往往不能完全分開。這種情況可以將第一次電泳分開的斑點通過支持介質間的接觸印跡轉移到第二個支持介質上，旋轉90°，進行第二次電泳。這種方法稱為雙向電泳。2、聚丙烯醯胺凝膠電泳：以聚丙烯醯胺凝膠為支持物，一般製成凝膠柱或凝膠板，凝膠是由相連的兩部分組成（小的部分是濃縮膠，大的部分為分離膠），這兩部分凝膠的濃度、緩沖液組分和離子強度、pH以及電場強度都是不同的，即不連續性。電泳時樣品首先在不連續的兩相間積聚濃縮而成很薄的起始區帶，然後再進行電泳分離。電泳有三種物理效應：1、樣品的濃度效應；2、凝膠對被分離分子的篩選效應；3、一般電泳分離的電荷效應。3、毛細管電泳：高效毛細管電泳、毛細管區帶電泳、自由溶液毛細管電泳、毛細管電泳，可分離氨基酸、肽、蛋白質、DNA片段和核酸以及多種小分子，也可用於手性化合物的分離。毛細管減少了由於熱效應產生的許多問題，可以提高熱散失，有助於消除由於熱引起的擴散增加而造成的對流和區帶變寬，因此管中不需要加入穩定介質即可進行自由流動電泳。電泳遷移引起溶液中荷電分子向相反電荷的電極移動，雖然被分析樣品因電泳遷移而分離，然而電滲作用使溶液向負極流動，而且電滲電流很強，其速度一般比樣品的電泳速率答，因此所有的正、負離子和中性分子都被推向負極。對荷正電分子來說，電泳遷移和電滲流效果是一致的，而且移動最快，最先達到負極。隨著被分離的分子接近負極，它們都將通過紫外檢測器並把信號傳遞給記錄儀。所得結果是被分離組分的紫外吸收對時間的峰譜。4、等點聚焦（IEF）分離蛋白質混合物是在具有pH梯度的介質（如濃蔗糖溶液）中進行。在外電場作用下各種蛋白質將移向並聚焦在等於其等電點的梯度處，並形成一個很窄的區帶。pH梯度製作一般利用兩性電解質，它是脂肪族多胺和多羧類的同系物，它們具有相近但不相同的解離常數和等電點。在外電場作用下，自然形成pH梯度。5、層析聚焦：根據蛋白質的等電點差異分離蛋白質混合物的柱層析方法。原理：當用特種緩沖液滴洗填充在柱中的特種多緩沖交換劑時，就會在層析柱中自上而下自動的建立起連續的pH梯度；同時加在柱上端的蛋白質樣品也隨多緩沖液的按各自的等電點聚焦在相應的pH區段。並在過程中隨pH梯度下移，蛋白質混合物的各組分先後從柱中流出，達到分離純化的目的。

❾ 凝膠過濾層析法加樣是應注意哪些問題

一般來分為三個步驟：裝柱源、加樣、洗脫淋洗。
裝柱是需要注意的是：【1】垂直放置 【2】放置產生氣泡 【3】放置柱分層
加樣時，【1】加樣前打開出口，使展開劑流出，至正好露出凝膠上平面時，立即關閉出口
【2】加樣時，用滴管緩緩沿柱內壁加入柱子
【3】打開柱子得出口，使待分離的樣品進入柱子。
加樣完成後，進行洗脫。