反向離子交換柱是啥意思

① 誰能告訴我一下反向液相色譜的工作原理嗎它與正向的有什麼區別嗎

高效液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。
1．液固色譜法 使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附－解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。適用於分離分子量200~1000的組分，大多數用於非離子型化合物，離子型化合物易產生拖尾。常用於分離同分異構體。
2．液液色譜法 使用將特定的液態物質塗於擔體表面，或化學鍵合於擔體表面而形成的固定相，分離原理是根據被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個分配平衡過程。
塗布式固定相應具有良好的惰性；流動相必須預先用固定相飽和，以減少固定相從擔體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區別常引起柱子的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復雜化。由於塗布式固定相很難避免固定液流失，現在已很少採用。現在多採用的是化學鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。
正相色譜法 採用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節組分的保留時間。常用於分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。
反相色譜法 一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節保留時間。適用於分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現代液相色譜中應用最為廣泛，據統計，它占整個HPLC應用的80%左右。
隨著柱填料的快速發展，反相色譜法的應用范圍逐漸擴大，現已應用於某些無機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在pH 1.5~10范圍操作。

正相色譜法與反相色譜法比較表

正相色譜法 反相色譜法
固定相極性 高～中 中～低
流動相極性 低～中 中～高
組分洗脫次序 極性小先洗出 極性大先洗出

從上表可看出，當極性為中等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。
3．離子交換色譜法 固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯形成的聚合物骨架，在表面未端芳環上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換，根據各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。
緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。被分離組分在離子交換柱中的保留時間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團作用強弱有關外，它還受流動相的pH值和離子強度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進而影響其與固定相的作用。流動相的鹽濃度大，則離子強度高，不利於樣品的解離，導致樣品較快流出。
離子交換色譜法主要用於分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。
4．離子對色譜法 又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物後，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用於分析離子強度大的酸鹼物質。
分析鹼性物質常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種鹼性樣品形成很強的離子對。
分析酸性物質常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。
離子對色譜法常用ODS柱（即C18），流動相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的離子對試劑，在一定的pH值范圍內進行分離。被測組分保時間與離子對性質、濃度、流動相組成及其pH值、離子強度有關。
5．排阻色譜法 固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進入孔中，滯留時間長；大分子量的化合物不能進入孔中，直接隨流動相流出。它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用於分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質、核酸等。

色譜法的基本原理
利用樣品混合物中各組分理、化性質的差異，各組分程度不同的分配到互不相溶的兩相中。當兩相相對運動時，各組分在兩相中反復多次重新分配，結果使混合物得到分離。
兩相中，固定不動的一相稱固定相；移動的一相稱流動相。
分類：
根據流動相分—以氣體作流動相—氣相色譜——固定相為液體 氣-液色譜
固定相為固體 氣-固色譜
—以液體作流動相—液相色譜——固定相為液體 液-液色譜
固定相為固體 液-固色譜
—當流動相是在接近它的臨界溫度和壓力下工作的液體時——超臨界色譜

根據固定相的附著方式
—固定相裝在圓柱管中—柱色譜
—固定相塗敷在玻璃或金屬板上—薄膜色譜（平板色譜）
—液體固定相塗在紙上—紙色譜（平板色譜）

根據分離機理
—分配色譜—樣品組分的分配系數不同
—吸附色譜— 樣品組分對固定相表面吸附力不同
—體積排阻色譜—利用固定相孔徑不同，把樣品組分按分子大小分開
—離子交換色譜—不同離子與固定相商相反電荷間的作用力大小不同

根據極性
—流動相極性＞固定相極性-反相色譜
—流動相極性＜固定相極性-正相色譜

氣相色譜只適合分析較易揮發、且化學性質穩定的有機化合物，而HPLC則適合於分析那些用氣相色譜難以分析的物質，如揮發性差、極性強、具有生物活性、熱穩定性差的物質。所以，HPLC的應用范圍已經遠遠超過氣相色譜。

一、吸附色譜（adsorption chromatography）
又叫液固色譜法：流動相是液體，固定相是固體。

分離原理：固定相是固體吸附劑，吸附劑是多孔性微粒物質表面有吸附中心。樣品組分與流動相競爭吸附中 心。各組分的吸附能力不同，使組分在固定相中產生保留時間不同和實現分離。

固定相： 固定相通常是強極性的硅膠、氧化鋁、活性炭、聚乙烯、聚醯胺等固體吸附劑。活性硅膠最常用。

流動相： 弱極性有機溶劑或非極性溶劑與極性溶劑的混合物，如正構烷烴（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲 烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。
應用： 對於極性，結構異構體分離和族分離仍是最有效的方法，如農葯異構體分離、石油中烷、烯、芳烴的 分離。 缺點是容易產生不對稱峰和拖尾現象。

二、分配色譜
原理： 固定液機械的吸附在惰性載體上，樣品分子依據他們在流動相和固定相間的溶解度不同，分別進入兩相分配而實現分離。
固定相：將一種極性或非極性固定液吸附在惰性固相載體上。如全多孔微粒硅膠吸附劑。
根據極性不同分類：正相分配色譜—固定相載體上塗布的是極性固定液；
流動相是非極性溶劑；
可分立極性較強的水溶性樣品；
弱極性組分先洗脫出來。

反相分配色譜—固定相載體上塗布的是非極性或弱極性固定液；
流動相是極性溶劑；
強極性組分先洗脫出來。
液-液分配色譜固定相中的固定液體往往容易溶解到流動相中去，所以重現性很差，且不能進行梯度洗脫，已經不大為人們所採用。

三、鍵合相色譜

考慮分配色譜法中固定液的缺點，因此將各種不同的有機關能團通過化學反應共價結合到固定相惰性載體上，固定相就不會溶解到流動相中去了。
鍵合固定相優點：○ 對極性有機溶劑有良好的化學穩定性
○使色譜柱的柱效高、壽命長
○實驗重現性好
○幾乎適於各種類相的有機化合物的分離，尤其是k』寬范圍的樣品
○可以梯度洗脫
根據極性不同分類：正相鍵合相色譜—固定相極性＞流動相極性
固定相：二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團的有機分子。
適於分離脂榮、水溶性的極性、強極性化合物

反相鍵合相色譜—固定相極性＜流動相極性
固定相：烷基、苯基等非極性有機分子。如最常用的ODS柱或C18柱就 是最典型的代表，其極性很小。
適於分離非機性、弱極性離子型樣品，
是當今液相色譜的最主要分離模式。
正相HPLC（normal phase HPLC）：
是由極性固定相和非極性（或弱極性）流動相所組成的HPLC體系。其代表性的固定相是改性硅膠、氰基柱等，代表性的流動相是正己烷。吸附色譜也屬正相HPLC。

反相HPLC（reversed phase HPLC）：
由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系，與正相HPLC體系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠(ODS柱，Octa Decyltrichloro Silane)，代表性的流動相是甲醇和乙腈。

四、體積排阻色譜（SEC，size exclusion chromatograghy）
（又稱凝膠色譜和分子篩色譜）
原理： 以多孔凝膠（如葡萄糖，瓊脂糖，硅膠，聚丙烯醯胺等）作固定相，依據樣品分子量大小達到分離目 的。大分子不進入凝膠孔洞，沿多孔凝膠膠粒間隙流出，先被洗脫；小分子進入大部分凝膠孔洞， 在柱中被強滯留，後被洗脫。

根據樣品性質分類：凝膠過濾（GFC）—用於分析水溶性樣品，如多肽、蛋白、生物酶、寡聚核苷酸、多聚核 苷酸、多糖。
凝膠滲透（GPC）—用於分析脂溶性樣品，如測定高聚物的分子量。

SEC主要依據分子量大小進行分離，因此與樣品、流動相間的相互作用無關。因此不採用改變流動相的組成來改善分離度。

五、離子交換色譜
（ion exchange chromatography, IEC）
分離原理：使用表面有離子交換基團的離子交換劑作為固定相。帶負電荷的交換基團（如磺酸基和羧酸基）可以用於陽離子的分離；帶正電荷的交換基團（如季胺鹽）可以用於陰離子的分離。不同離子與交換基的作用力大小不同，在樹脂中的保留時間長短不同，從而被相互分離。