反滲透膜制孔添加PEG

㈠ 為什麼PEG能模擬乾旱環境

2018年初，安徽農業大學茶葉生物學與資源利用國家重點實驗室主任、宛曉春教授課題組，針對茶樹葉肉細胞質膜H+-ATPase在乾旱和復水條件下調節鉀穩態的研究成果，在The Crop Journal上發表題為Maintenance of mesophyll potassium and regulation of plasma membrane H+-ATPase areassociated with physiological responses of teaplants to drought and subsequent rehydration的研究成果。這是利用非損傷微測技術（Non-invasive Micro-test Technology, NMT），首次將離子流與膜電位數據相結合，測定茶樹葉肉細胞H+、K+和膜電位，揭示茶樹在乾旱和復水處理下生理的機制變化。張顯晨博士為本文第一作者。

活體葉肉細胞H+流、K+流檢測。

茶樹在乾旱、復水條件下，葉肉細胞K+流變化。正值代表外排。

旱害嚴重影響茶樹生長發育，造成茶葉減產和品質下降。揭示茶樹抗旱機理，對培育耐旱茶樹品種，應對乾旱脅迫具有重要的理論意義。

課題組以茶樹一葉為研究對象，通過PEG和復水模擬乾旱和補水灌溉。乾旱抑制茶樹葉肉細胞質膜H+-ATPase活性，誘導H+內流，介導膜電位去極化，激活K+外排，削弱了葉肉細胞對K+的滯留；復水激活了茶樹葉肉細胞質膜H+-ATPase活性，加劇H+外排，超極化膜電位，抑制了K+外排，促進了葉肉細胞對K+的滯留。因此推測葉片質膜H+-ATPase可能參與調控茶樹葉片鉀穩態對乾旱和復水響應。

茶樹在乾旱、復水條件下，葉肉細胞膜電位變化

本文第一作者，來自茶葉生物學與資源利用國家重點實驗室的張顯晨博士，一直專注茶樹逆境研究，已經利用非損傷微測技術，在茶樹氟富集、乾旱脅迫、酸脅迫、鋁脅迫等方向，發表3篇SCI文章、1篇中文核心文章。

Efficient iron plaque formation on tea(Camellia sinensis) roots contributes to acidic stress tolerance. JIntegr Plant Biol. 2018, doi: 10.1111/jipb.12702.
Maintenance of mesophyll potassium andregulation of plasma membrane H+-ATPase are associated with physiologicalresponses of tea plants to drought and subsequent. Crop J. 2018,6(6):611-620.
Al3+-promoted fluorideaccumulation in tea plants (Camellia sinensis) was inhibited by an anionchannel inhibitor DIDS. J Sci Food Agric. 2016, 96(12):4224-30.
Ca2+ 信號在DIDS( 4，4－二異硫氰－2，2－二磺酸)抑制茶樹吸收氟的功能研究. 南京農業大學學報.2016.

本文第一作者、安徽農業大學張顯晨博士，接受中關村NMT聯盟采訪

致 謝

㈡ 化學里PEG的結構和性質，要全面的，可不斷追加給高分

葯用聚乙二醇

組成：乙二醇和環氧乙烷聚合物 別名：碳蠟、PEG

結構式：CH2（OH）-（CH2CH2O）n -CH2OH

目前加工系列產品有：
PEG-4000 120～400(目)
PEG-6000 120～500(目)
PEG-8000 120～600(目)
PEG-20000 120～800(目)

性狀及用途：
聚乙二醇系列產品通常情況下溶於水和多種有機溶劑，不溶於脂肪烴、苯、乙二醇等，不會水解變質，有廣泛的溶解范圍和優良的相容性、很好的穩定性、潤滑性、成膜性、增塑性、分散性等。系低毒物質，且無刺激性，屬非離子型聚合物。

應 用：
聚乙二醇的應用有兩種方式：一種是PEG包含在最終產品中，例如：醫葯用的油膏、軟膏、洗液、栓劑、片劑和非腸道用溶液；在化妝品中的牙膏、發乳、除臭劑、洗凈膏；造紙工業中用於壓光紙；尼龍纖維、賽璐璐薄膜、粘合劑、洗滌劑、焊劑、清漆及照相顯影劑等。另一種是為許多產品提供潤滑性，如：金屬、瓷磚、瓷品的成形潤滑劑，紡絲和紡織纖維、制輪胎和醫療外科縫線的潤滑劑，乳膠泡沫製成的脫膜劑等。

聚乙二醇200：可作為有機合成的介質及有較高溫度要求的熱載體，在日用化學工業作保濕劑和無機鹽增溶劑，粘度調節劑。在紡織工業中用作柔軟劑、抗靜電劑、造紙與農葯工業中潤濕劑。

聚乙二醇400、600：用作醫葯，化妝品的基質，橡膠與紡織工業的潤滑劑和潤濕劑。600在木材工業中作保濕劑，在金屬工業加於電解液中可增強研磨效果，增強金屬表面的光澤。

聚乙二醇1000-1500：在醫葯、紡織、化妝品工業中用作基質或潤滑劑、柔軟劑；塗料工業中作分散劑，改進樹脂的水分散性、柔韌性，用量為10-30%；油墨中可提高染料的溶解能力，降低其揮發性；在蠟紙和印台油墨中尤為適用；也可在圓珠筆油墨中作調節油墨粘稠度用；橡膠工業用作分散劑，以促進硫化作用，以及用作碳黑填充料的分散劑。

聚乙二醇2000-3000：用作金屬加工鑄膜劑，金屬拉絲、沖壓或成型的潤滑劑及切削液，研磨冷卻拋光劑、焊接劑，造紙工業中作潤滑劑。

聚乙二醇4000-6000：在醫葯、化妝品工業中用作基質，起調節粘度、熔點的作用。在橡膠、金屬加工工業中作潤滑劑、冷卻劑，在農葯、顏料工業生產中作分散劑、乳化劑，紡織工業中用作抗靜電劑、潤滑劑。

包裝及貯存：
聚乙二醇200-600用50kg塑料桶；聚乙二醇1000用10kg塑料桶；聚乙二醇1500-6000用25kg紙袋。貯存於陰涼、乾燥處，注意防火，避免與熱和氧化物接觸。

㈢ 為什麼PEG-400是增塑劑,而PEG-2000是致孔劑

聚乙二醇與許多有機物組份都具有良好的相溶性
PEG-200 無色透明 平均分子量版在190-210萬左右，權 粘度為22-23
PEG-2000 白色固體 平均分子量1800-2200 粘度5.0-6.7
它們都可以用作潤滑增塑，只是 PEG-200更容易分散，好混配。

㈣ 說明對於PSf+PEG+DMAc體系制備PSf膜時，三個組成分別起到什麼作用

晚上好，PSf是主要成膜高聚物為單體，PEG是增塑劑和柔軟劑為成膜提供必要的機械強度，DMAc是主要溶劑為溶解PSf至均勻分散的液相請酌情參考。其中一般情況下PSf是不可替換的，PEG和DMAc可以換成對成膜有利的任意溶劑比如PPG、乙二醇或者丙三醇（也可以換成鄰苯二甲酸酯），和DMF、DEF或者NMP。

㈤ GOPEG化學中是什麼意思

GOPEG化學中是什麼意思
濾芯功能：

PP棉：對原水進行初過濾，去除水中較粗顆粒雜質、污泥、膠體版、懸浮權物質等。

顆粒活性炭：吸附水中異味、異色、有機物、部分重金屬等

碳棒活性炭：進一步去除氯、有機化合物、異色、異味、濁度等。

RO反滲透膜：孔徑0.1納米，清除水中細菌、病毒、重金屬、等有機雜質。

後置活性炭：調節出水的PH值、改善口感。

㈥ PEG聚乙二醇濃縮的原理

蛋白質濃縮

濃縮

生物大分子在制備過程中由於過柱純化而樣品變得很稀，為了保存和鑒定的目的，往往需要進行濃縮。常用的濃縮方法的：

減壓加溫蒸發濃縮
通過降低液面壓力使液體沸點降低，減壓的真空度愈高，液體沸點降得愈低，蒸發愈快，此法適用於一些不耐熱的生物大分子的濃縮。
空氣流動蒸發濃縮 空氣的流動可使液體加速蒸發,鋪成薄層的溶液，表面不斷通過空氣流；或將生物大分子溶液裝入透析袋內置於冷室，用電扇對准吹風，使透過膜外的溶劑不沁蒸發，而達到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適於大量溶液的濃縮。
冰凍法 生物大分子在低溫結成冰，鹽類及生物大分子不進入冰內而留在液相中，操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然後緩慢地融解，利用溶劑與溶質融點介點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質和酶的鹽溶液用此法濃縮時，不含蛋白質和酶的純冰結晶浮於液面，蛋白質和酶則集中於下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質和酶的濃縮液。
吸收法 通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學反應，對生物大分子不吸附，易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋裡，外加聚乙二醇復蓋置於4度下，袋內溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水飽和後要更換新的直至達到所需要的體積。
超濾法 超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方法，不液體在一定壓力下（氮氣壓或真空泵壓）通過膜時，溶劑和小分子透過，大分子受阻保留，這是近年來發展起來的新方法，最適於生物大分子尤其是蛋白質和酶的濃縮或脫鹽，並具有成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性，回收率高等優點。應用超濾法關鍵在於膜的選擇，不同類型和規格的膜，水的流速，分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量值）等參數均不同，必須根據工作需要來選用。另外，超濾裝置形式，溶質成份及性質、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響。Diaflo 超濾膜的分子量截留值
膜名稱
分子量截留值
孔的大的平均直徑

XM －300
300，000
140

XM－200
100，000
55

XM－50
50，000
30

PM－30
30，000
22

UM－20
20，000
18

PM－10
10，000
15

UM－2
1，000
12

UM05
500
10

用上面的超濾膜製成空心的纖維管，將很多根這樣的管攏成一束，管的兩端與低離子強度的緩沖液相連，使緩沖液不斷地在管中流動。然後將纖維管浸入待透析的蛋白質溶液中。當緩沖液流過纖維管時，則小分子很易透過膜而擴散，大分子則不能。這就是纖維過濾秀析法，由於透析面積增大，因而使透析時間縮短10倍。

㈦ peg 7甘油椰油酸酯在化妝品生產中的作用與其性質

peg 7甘油椰油酸酯是一種天然油脂與環氧乙烷反應製得的親水性潤膚酯，可用於表面活專性劑體系補充屬油脂，富脂添加劑，對泡沫影響小，可替代水溶性羊毛，作為油脂可溶於透明產品中，可維持皮膚和頭發的油脂平衡，減少乾燥感，增加皮膚和頭發的潤滑感，適用於各種洗澡、水劑產品。

廣泛的應用於香波、浴液洗面奶、泡沫浴露用富脂劑等個人清潔用品中。

peg 7甘油椰油酸酯最大的作用就是與油脂有互溶性，且黏度低，延展性好，對皮膚滲透性好。同時具有調理機能，滋潤肌膚的功效。

缺點：對眼睛具有較強的刺激性。

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貯存方法：

1、貯存於清潔乾燥處，應注意密封貯存。注意防潮，防水，防熱，嚴禁與強氧化劑混放。

2、貯運中要防潮、防熱、防水。禁止與強氧化劑（如硝酸、高錳酸鉀等）放在一起。按一般易燃化學品規定貯運。

甘油椰油酸酯的特點：

適用於水溶液的分析、溶劑、氣量計及水壓機緩震液、軟化劑、抗生素發酵用營養劑、乾燥劑、潤滑劑、制葯工業、化妝品配製、有機合成、塑化劑。可與水以任何比例溶解，低濃度丙三醇溶液可做潤滑油對皮膚進行滋潤。

㈧ PEG在電鍍中做什麼用

PEG（聚乙二醇）是電鍍銅中用得比較多的一種添加劑，其阻化銅的電沉積的解釋理論較專多，總的傾向於PEG分子屬的氧原子因靜電反應呈螺旋狀卷繞在Cu+的周圍，Cu+與吸附於表面的Cl-發生靜電反應，在陰極表面形成陰極膜，陰極膜減慢了陰極反應速度。
表面阻化膜的穩定性與PEG的分子量有關，相對分子質量越大吸附膜越穩定，膜的阻化
作用越強。當PEG相對分子質量太小時，在電極表面得不到緻密的阻化層；太大時，其對銅的電沉積抑製作用受強制對流的影響比較大。
相對分子質量在6 000~8 000的PEG與SPS、Cl-聯合運用能得到較好的填充效果。
據研究，在酸性鍍銅溶液中添加不同分子量的PEG對直徑為50微米、深徑比為1的鍍層盲孔填充效果的影響.結果表明,隨著PEG分子量的增加,電鍍銅溶液的微孔填充力明顯提高。

㈨ PEG介導的原生質體轉化

此方法首先要獲得去細胞壁的原生質體，可用胞壁降解酶除去芽管或菌絲的細胞壁。通常使用的是酶混合物，例如纖維素酶、蝸牛酶、溶壁酶等，這些胞壁降解酶混合使用通常會更好地發揮去壁作用，在原生質體准備過程中，要求滲透壓穩定劑。1987年Penttila等第一次在里氏木霉（Trichoderma reesei）原生質體制備基礎上利用PEG介導實現木霉的轉化，以後的其他研究者的木霉PEG轉化大多是在他的基礎上進行改良而來，在原生質制備過程中成功使用山梨醇保持滲透壓穩定，濃度為1.2M，MgSO₄可以作為替代品。此外，有些真菌使用甘露醇或NaCl也是可行的（Fincham et al.，1989）。T.reesei使用1.0～1.2M的山梨醇可有效控制滲透壓穩定性，後代再生率為90%。經過PEG轉化，原生質體再生率從90%降至12%～35%。PEG轉化技術的主要優勢在於盡管不同物種的原生質體形成和傳代是非常多樣的，但該方法均可適用。一般來說，原生質體儲存越久，轉化效果越差（Penttila et al.，1987b），所以原生質體需要現用現制備。此外，原生質體常常不止一個細胞核，這需要做長時間凈化處理以得到同核體。

PEG介導的原生質體轉化法是通過PEG的介導作用將遺傳因子轉入受體細胞原生質體中的一種方法，原生質體的制備與再生是轉化的關鍵，此外CaCl₂也是不可或缺的成分。目前，多數絲狀真菌的轉化以原生質體作為感受態細胞，在一定濃度的CaCl₂和PEG等條件下和需轉化的外源DNA混合完成的。因此，PEG介導的原生質體轉化法包括原生質體的制備和原生質體轉化兩個主要過程。

8.1.1.1 原生質體的制備與再生

原生質體制備的最大障礙就是細胞壁，木黴菌細胞壁的主要成分為多糖，其次為蛋白質、類脂。多糖主要有幾丁質、纖維素、葡聚糖、甘露聚糖等。因此，目前主要通過使用纖維素酶、蝸牛酶或溶壁酶等酶法去除細胞壁。具體採用的酶種類、濃度等需要通過具體的實驗來確定。影響原生質體制備的因素很多，不同的木霉有其較為適當的形成條件。主要考慮的因素有：①菌齡的選擇。菌絲的菌齡對原生質體的產量影響很大，不同菌齡的菌絲在同樣的條件下酶解所得到的結果不同，利用合適菌齡的菌絲所得的原生質體明顯較多，這與許多黴菌的原生質體分離的情況相似，菌齡過長，菌絲細胞壁發生老化增厚，不易於釋放原生質體，菌齡過短則菌絲體易破裂，釋放原生質體數量較少，因此，需要針對不同的菌株生長發育情況具體確定合適的菌齡。②破壁酶系統的選擇。適當的破壁酶組合是成功地釋放原生質體的關鍵。由於真菌的細胞壁組成復雜，使用單一酶類處理一般效果不理想，所以，通常會採用多個酶的組合配製成復合酶液，並確定相應的酶解時間和酶解溫度等相關條件。③滲透壓穩定劑對原生質體釋放的影響。形成原生質體後，細胞膜失去細胞壁的保護，容易破損，不易保存，而滲透壓穩定劑可以維持原生質體細胞膜內外壓力恆定和原生質體形狀，使原生質體不易破裂且有助於後續試驗的進行。因此，滲透壓穩定劑是影響原生質體產量的關鍵因素之一。常用的滲透壓穩定劑有山梨醇、葡萄糖、甘露醇、蔗糖、MgCl₂、KCl、NaCl等，例如Penttila等（1987b）在制備T.reesei原生質體時使用山梨醇保持滲透壓穩定，濃度為1.2M，濃度為1.2M的MgSO₄也可作為替代的材料。此外，針對某些真菌使用甘露醇或NaCl也是可行的（Fincham et al.，1989）。針對木霉的原生質體制備有選用無機鹽的，例如田媛等（2010）制備康寧木霉（T.koningii）原生質體時發現無機鹽溶液有利於原生質體的釋放，而糖醇類不利於原生質體釋放。原因可能是無機鹽能夠促進酶的活性，使酶與細胞能夠充分接觸。滲透壓緩沖液中NaCl最好，KCl次之。而趙樂輝等（2005）在制備木霉T21和T22原生質體時發現蔗糖和甘露醇最合適，所以具體選用什麼試劑作為制備原生質體的滲透壓穩定劑還需根據具體情況來定奪。

原生質體的再生是進行轉化後篩選的關鍵步驟，每個再生後的原生質體可以成為一個無性生殖體，影響再生的因素很多，主要有：①酶濃度和酶解時間。酶濃度對原生質體再生影響很大，由於使用的破壁酶多數為復合酶，其中會含有對原生質體有害的酶類（例如過氧化物酶、核糖核酸酶等），這些酶必然會影響原生質體的活性。過高的酶濃度使細胞破壁太徹底導致原生質體的細胞膜破裂，使再生率降低。酶解時間對原生質體產量和再生有雙重影響。酶解時間短，對原生質體活性影響較小，因而有利於再生，但是原生質體的產量相對低；而延長酶解時間，雖然可以提高原生質體產量，但對原生質體活性影響較大，因而原生質體的再生率明顯降低。所以，酶解時間的選定要統籌考慮原生質體的產出率和再生率。②滲透壓穩定劑的影響。有些無機鹽有利於原生質體的產出，但再生時可能在平板周圍形成高鹽環境而不利於菌落的形成，而使用糖醇類的滲透壓穩定劑由於其對原生質體具有保護作用，還可作為營養利於菌絲生長，所以可能比無機鹽更有效。③不同再生培養基對原生質體再生有顯著影響。例如黃玉茜等（2005）發現，將制備好的木黴菌T23原生質體分別在基礎培養基、完全培養基、改良查氏培養基上再生，結果表明，在基礎培養基上再生率最高，平均達到25.4%，其次為完全培養基，再生率平均為21.3%，改良查氏培養基的再生效果最差。

再生率＝（高滲溶液稀釋所長出的菌落數-用無菌水長出的菌落數）/加入原生質體數×100%

在液體再生培養基中可以觀察到原生質體的再生方式，木霉的原生質體通常會在滲透壓穩定劑的作用下，液泡吸水而膨大，在體內形成一個或多個大液泡，並向一端伸展，失去圓球形狀，並形成不規則的突起，不規則的突起然後類似出芽狀長出念珠狀畸形萌發管，最後發育成正常菌絲。

8.1.1.2 原生質體轉化

原生質體與外源DNA在包含CaC1₂的PEG緩沖液中混合，最後將原生質體塗布於再生培養基中選擇轉化子。其主要原理是PEG能使細胞膜之間或DNA與膜之間形成分子橋，促使細胞接觸和粘連；或是通過引起表面電荷紊亂，干擾細胞間的識別，而有利於細胞間的融合或外源DNA的進入。一般認為，PEG與細胞膜內的水、蛋白質和糖類分子形成氫鍵，使得原生質體連在一起而發生凝聚，並由於Ca²⁺的存在而加強，這種細胞間凝聚能夠促進DNA的吸收。PEG濃度過高或作用時間過長，易於使原生質脫水破裂，失去再生活性，從而使轉化率下降。

為了篩選轉化子，轉化載體一般需要攜帶抗性標記基因，按基因編碼產物的功能可將這些選擇標記分為三大類，即營養缺陷型標記、葯物抗性標記和功能產物標記：

（1）營養缺陷型標記：包括一些碳源、氮源和硫源的代謝基因，它們能與相應的營養缺陷型絲狀真菌受體菌遺傳互補，從而通過營養缺陷篩選出目標轉化子，常見的營養缺陷篩選有編碼精氨酸生物合成途徑中鳥氨酸氨甲酞轉移酶的argB⁺基因和編碼尿嘧啶生物合成途徑中的乳清苷-5』-磷酸脫羧酶的Pyr4⁺基因。

（2）葯物抗性標記：目前常用的葯物抗性標記有編碼苯菌靈抗性的bml基因，編碼寡黴素抗性的oliC基因；還有來自細菌的潮黴素抗性基因（hygB）、苯並咪唑類殺菌劑抗性基因 Ben^R、博來黴素抗性基因（Zeo^R）、G418 抗性基因（Neo^R）、抗硫胺素基因（ptrA）、腐草黴素抗性基因及氨基糖苷類，大環內酯類，金屬糖肽類抗生素抗性基因等，其中，潮黴素抗性基因的應用最為廣泛。

（3）功能標記：構巢麴黴（Aspergillus nilans）amds基因編碼乙酞胺酶，而黑麴黴菌及許多其他的絲狀真菌不能合成此酶，因此，將這些絲狀真菌塗布在以乙酞胺為唯一碳源或氮源的選擇性培養基上，即可方便地篩選攜帶amds型質粒的轉化子。1995年Thrane等通過PEG介導的原生質體轉化方法將來源於大腸桿菌的β-葡萄糖醛酸苷酶（GUS）基因和綠色熒光蛋白（GFP）基因轉入哈茨木霉（T.harzianum）T3中，木黴菌轉化子也可在x-gal平板上呈現藍色反應或在熒光顯微鏡下分生孢子梗和分生孢子被觀察到綠色熒光的存在，可用於木黴菌的在植物上定殖和在土壤等環境中的分析檢測研究。

大多數絲狀真菌的轉化載體在宿主菌中不能自主復制，而是同源或者異源整合到宿主菌的基因組中。重組效率依賴於多種因素，包括轉化的方法和條件、轉化的宿主菌、轉化的DNA片段與宿主基因組的同源程度及同源序列的長度等。營養缺陷型標記有可能引導載體質粒整合染色體的同源部位，易於篩選，但作為受體的營養缺陷型的篩選比較困難，特別是對一些工業生產菌、病原菌和多倍體菌株幾乎難以實現，而葯物抗性標記和功能標記則避免了前者的缺點，但帶來的環境生物安全問題值得探討。即使不存在任何選擇性壓力，轉化子在有絲分裂過程中會表現出高度的不穩定性，抗葯性篩選容易出現陽性假轉化子現象。大多數的絲狀真菌轉化實驗都證明了這一點，尤其對粗糙脈袍菌的轉化實驗。轉化子DNA丟失不穩定的原因可能有部分重復DNA的甲基化、DNA的被切割和DNA重排等。下面提供一種本實驗室常用轉化木霉方法，僅供參考，具體步驟如下：

（1）原生質制備：取1mL木霉分生孢子懸浮液（1×10⁸孢子/mL）接種到PD中，28℃下振盪培養20h。用4層無菌紗布過濾收集菌絲體，無菌水沖洗5次，0.16M KCl沖洗至菌絲半透明。向菌絲中加入2mL濃度為10mg/mL的溶菌酶，混勻，30℃下放置3h後用4層紗布過濾，0.6M KCl沖洗。濾液在5000r/min下離心15min。獲得的原生質體用STC［原生質體保存培養基，0.6M蔗糖、10mmTris-HCl（pH8.0）、10mmCaCl₂］沖洗兩遍，懸浮於STC中在4℃下保存。

（2）原生質體再生：先在培養皿底部鋪上一薄層OcmBOTTOM培養基（1mol/L蔗糖的CM培養基；OcmTOP培養基：OCM中加入1%瓊脂；OcmBottom培養基：OCM中加入1.5%瓊脂），再將原生質體與冷卻至40～45℃的再生培養基輕輕混合，倒入上述平板，黑暗培養4～5d，計再生菌落數。原生質體再生率計算：

原生質體再生率＝再生培養基上生長的菌落數（個）∕塗布原生質體數量（個）×100%

（3）原生質體轉化：將准備好的質粒5μg加入含有200μL原生質體的50mL離心管中混合均勻，室溫下靜置20min；加入1mL40%PTC［原生質體再生培養基，1×STC中含40%（W/V）PEG8000］，0.22μm細菌過濾器過濾除菌到管中，輕輕混勻，室溫下靜置20min；加入5mL TB3（含50μg/mL 氨苄青黴素），室溫、175r/min下搖床培養過夜。

（4）原生質體篩選：將培養過夜的原生質體在3500r/min下離心10min，棄上清液，用剩餘大約5mL的殘液懸浮沉澱；融化Bottom Agar培養基並冷卻到65℃，轉移10mL Bottom Agar培養基到含有已復生原生質體的50mL離心管中，加入氨苄青黴素到終濃度50μg/mL，混勻後快速倒入平板；25℃培養10h後，再倒上含有較高濃度潮黴素的Top Agar篩選培養基，25℃下培養2～3d後，挑取平板上的單個菌落，轉接含有無抗培養基上培養傳代，並經過PCR鑒定和southern blot鑒定確定轉化子。