阴阳离子交换层析纯化水实验

Ⅰ 离子交换层析的原理是什么 已解决

离子交换层析法是从复杂的混合物中，分离性质相似大分子的方法之一，依据版的原理是物质的酸碱性，极权性，所带阴阳离子的不同。电荷不同的物质，对管柱上的离子交换剂有不同的亲和力，改变冲洗液的离子强度和pH值，物质就能依次从层析柱中分离出来。

层析开始前，功能基团与反离子稳定结合，就与反离子发生可逆交换，与层析剂结合被固定下来。因为盐离子可以与底物竞争功能基团，盐浓度越高样品与层析剂结合越不紧密，易被洗脱下来。不同物质与层析剂结合程度不同，洗脱下来的时间不同，因此得以分开。

(1)阴阳离子交换层析纯化水实验扩展阅读

离子交换剂的选择首重保持欲分离物质的生物活性，以及在不同pH值环境中，此物质所带的电荷和电性强弱，阴阳离子交换剂的选择若被分离物质带正电荷，这些碱性蛋白质，它们在酸性溶液中较稳定，亲和力强，故采用阳离子交换剂。

在碱性溶液中较稳定，则使用阴离子交换剂，如果欲分离的物质是两性离子，一般考虑在它稳定的pH范围带有何种电荷，作为交换剂的选择。离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生，若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤。

Ⅱ 单克隆抗体的纯化技术操作步骤

从培养液或腹腔积液获得的单克隆抗体，不需要纯化即可应用于日常诊断或定性研究。如果用于免疫标记测定，须分离和纯化。可用半饱和、饱和硫酸铵进行沉淀，进行初步浓缩和纯化；可用亲和层析法进一步纯化。

一、腹水型单抗的纯化

在单抗纯化之前，一般均需对腹水进行预处理，目的是为了进一步除去细胞及其残渣、小颗粒物质、以及脂肪滴等。常用的方法有二氧化硅吸附法和过滤离心法，以前者处理效果为佳，而且操作简便。

1、二氧化硅吸附法

新鲜采集的腹水（或冻存的腹水），2000r/min 15分钟，除去细胞成分（或冻存过程中形成的固体物质）等；取上层清亮的腹水，等量加入PH7.2巴比妥缓冲盐水（VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg2+，0.3mmol/L Ca2+）稀释；然后以每10ml稀释腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，悬液在室温孵育30分钟，不时摇动；2000g离心20分钟，脂质等通过该法除去，即可得澄清的腹水。

2、过滤离心法

用微孔滤膜过滤腹水，以除去较大的凝块及脂肪滴；用10000g 15分钟高速离心（4℃）除去细胞残渣及小颗粒物质。

3、混合法

即上述两法的组合，先将腹水高速离心，取上清液再用二氧化硅吸附处理。

二、单抗的粗提

1、硫酸铵沉淀法

（1）饱和硫酸铵溶液的配制

500g硫酸铵加入500ml蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出的结晶任其留在瓶中。临用前取所需的量，用2mol/L NaOH调PH至7.8。

（2）盐析

吸取10ml处理好的腹水移入小烧杯中，在搅拌下，滴加饱和硫酸铵溶液5.0ml；继续缓慢搅拌30分钟；10000r/min离心15分钟；弃去上清液，沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮，搅拌作用30分钟，同法离心；重复前一步1-2次；沉淀物溶于1.5ml PBS（0.01mol/L PH7.2）或Tris-HCl缓冲液中。

（3）脱盐

常用柱层析或透析法。柱层析法是将盐析样品过Sephadex G-50层析柱，以PBS或Tris-HCl缓冲液作为平衡液和洗脱液，流速每分钟1ml。第一个蛋白峰即为脱盐的抗体溶液。透析法是将透析袋于2% NaHCO3，1mmol/L EDTA溶液中煮10分钟，用蒸馏水清洗透析袋内外表面，再用蒸馏水煮透析袋10分钟，冷至室温即可使用（并可于0.2mol/L EDTA溶液中，4℃保存备用）。将盐析样品装入透析袋中，对50-100倍体积的PBS或Tris-HCl缓冲液透析（4℃）12-24小时，其间更换5次透析液，用萘氏试剂（碘化汞11.5g，碘化钾8g，加蒸馏水50ml，待溶解后，再加20% NaOH 50ml）检测，直至透析外液无黄色物形成为止。

（4）蛋白质含量的测定

（Pr）（mg/ml）=（1.45×OD280-0.74×OD260）×稀释倍数；或（Pr）=OD280×稀释倍数/1.3

（5）分装冻存备用

2、辛酸-硫酸铵沉淀法

该法简单易行，适合于提纯IgG1和IgG2b，但对IgG3和IgA的回收率及纯化效果差。其主要步骤如下：取1份预处理过的腹水加2份0.06mol/L PH5.0醋酸缓冲液，用1mol/L HCl调PH至4.8；按每毫升稀释腹水加11ul辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4℃静置2小时，取出15000g离心30分钟，弃沉淀；上清经尼龙筛过滤（125um），加入1/10体积的0.01mol/L PBS，用1mol/L NaOH调PH至7.2；在4℃下加入饱和硫酸铵至45%饱和度，作用30分钟，静置1小时；10000g离心30分钟，弃上清；沉淀溶于适量PBS（含137mmol/L NaCl，2.6mol/L KCl，0.2mmol/L EDTA）中，对50-100倍体积的PBS透析，4℃过夜，其间换水3次以上；取出10000g离心30分钟，除去不溶性沉渣，测定蛋白质含量后，分装，冻存备用。

3、优球蛋白沉淀法

该法适用于IgG3和IgM型单抗的提取，所获制品的抗体活性几乎保持不变，对IgG3单抗的回收率高于90%，对IgM单抗的回收率为40-90%不等。其操作步骤如下：取一定量的预处理过的腹水，先后加入NaCl和CaCl2，使各自的浓度分别达0.2mol/L和25mmol/L，随之可见纤维蛋白的产生；经滤纸过滤后，滤液对100倍体积的去离子水透析，4℃ 8-15小时（若是IgG3单抗，也可室温2小时），其间换水1-2次；取出后22000g离心30分钟，弃上清；将沉淀溶于PH8.0 1mol/L NaCl，0.1mol/L Tris-HCl溶液中，重复上述的透析与离心；将沉淀的优球蛋白浓度调至5-10mg/ml，分装冻存备用。

三、单抗纯化的方法

单抗纯化的方法有很多种，应根据具体单抗的特性和实验条件选择适宜的方法，常用的技术有DEAE离子交换层析柱、凝胶过滤法和亲和层析法三种。

1、离子交换层析：

分离蛋白质是根据在一定pH 条件下，蛋白质所带电荷不同而进行的分离方法。常用于蛋白质分离的离子交换剂有弱酸型的羧甲基纤维素(CM纤维素) 和弱碱型的二乙基氨基乙基纤维素(DEAE纤维素)。前者为阳离子交换剂，后者为阴离子交换剂。

离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来

2、凝胶过滤法：

一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外。洗脱时，大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小，小分子则在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大。

缺点：从凝胶过滤的原理可知，蛋白质分子通过凝胶柱的速度(即洗脱体积的大小)并不直接取决于分子的质量，而是它的斯笃克半径，利用凝胶过滤法测定蛋白质分子量时，标准蛋白质(已知分子量和斯笃克半径)和待测蛋白质必须具有相同的分子形状(接近球体)，否则不能得到比较准确的分子量。分子形状为线形的或与凝胶能发生吸附作用的蛋白质，则不能用此方法测定分子量。而且柱子成本比较高，整个实验过程耗时很长。

3、免疫亲和层析法：

是利用生物体内存在的抗原、抗体之间高度特异性的亲和力进行分离的方法。亲和层析的应用主要是生物大分子的分离、纯化。利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。例如将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体。在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓度通常较低。

用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进行分离，而亲和层析法则是一种非常有效的方法。将所需蛋白质作为抗原，经动物免疫后制备抗体，将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂，就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。

Ⅲ 离子交换怎么试验

离子交换法是一种借助于离子交换剂上的离子和废水中的离子进行交换反应而除去废水中有害离子的方法。离子交换是一种特殊吸附过程，通常是可逆性化学吸附；其特点是吸附水中离子化物质，并进行等电荷的离子交换。
离子交换剂分无机的离子交换剂如天然沸石，人工合成沸石，及有机的离子交换剂如磺化煤和各种离子交换树脂。
在应用离子交换法进行水处理时，需要根据离子交换树脂的性能设计离子交换设备，决定交换设备的运行周期和再生处理。通过本实验希望达到下述目的：
1) 加深对离子交换基本理论的理解；学会离子交换树脂的鉴别；
2) 学会离子交换设备操作方法；
3) 学会使用手持式盐度计，掌握pH计、电导率仪的校正及测量方法。
二、实验内容和原理
由于离子交换树脂具有交换基因，其中的可游离交换离子能与水中的同性离子进行等当量交换。 用酸性阳离子交换树脂除去水中阳离子，反应式如下：
nRH + M+n → RnM + nH+
M——阳离子 n——离子价数
R——交换树脂
用碱性阴离子交换树脂除去水中的阴离子，反应式如下：
nROH + Y−n → RnY + nOH-
Y——阴离子
离子交换法是固体吸附的一种特殊形式，因此也可以用解吸法来解吸，进行树脂再生。
本实验采用自来水为进水，进行离子交换处理。因为自来水中含有较多量的阴、阳离
子，如Cl¯， NH4+，Ca，Mg，Fe，Al，K，Na等。在某些工农业生产、科研、医疗卫生等工作中所用的水，以及某些废水深度处理过程中，都需要除去水中的这些离子。而采用离子交换树脂来达到目的是可行的方法。

Ⅳ 如果一个蛋白质只是在PH6-6.5范围内稳定，请设计一个通过离子交换层析纯化该蛋白质的实验

你是不是说混淆了，到底是等电点在pH6-6.5？还是等电点未知，确在6-6.5稳定？
我就先按等电点来理解，回答你的问题。
如果对蛋白纯化的浓度要求不高，或者待纯化样品成分简单，杂蛋白少，就选一种离子交换层析，即阳离子离子交换层析（running buffer 设pH5.0比较合适）或阴离子交换层析（running buffer 设pH7.5比较合适）。
如果杂蛋白多，就用两步离子交换层析，即结合阴阳离子交换层析。一般建议先做阳离子交换层析（这样第一步可去掉核酸之类的）。不知你要多具体的步骤，先写个大致步骤吧：
1，阳离子交换层析：将你的样品置换到pH5.0的running buffer（一般醋酸钠buffer）。同时装住，平衡啥的，然后上样，平衡，洗脱（升pH或盐洗脱），收峰。这步就去掉等电点在6之下的大部分杂蛋白；
2，阴离子交换层析：将所收蛋白置换buffer至pH7.5的running buffer（PB），同时装住，平衡啥的，然后上样，平衡，洗脱（降pH或盐洗脱），收峰。去掉pH6.5之上的大部分杂蛋白。
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如果你确实所指在6-6.5稳定，那就看你蛋白的等电点在多少了，只好选一种离子交换层析，在6.5之上就试试pH6.0的running buffer做阳离子交换层析，在6.0之下，就试试pH6.5的running buffer做阴离子交换层析。
若有疑问，欢迎继续讨论，纯属手打，欢迎采纳，祝新年愉快！

Ⅳ 简述采用离子交换法制备纯化水的过程

离子交换设备介绍
离子交换设备是一种传统的、工艺成熟的脱盐处理设备，其原理是在一定条件下，依靠离子交换剂（树脂）所具有的某种离子和预处理水中同电性的离子相互交换而达到软化、除碱、除盐等功能。用于深度脱盐处理，产水电阻率动态可达到18MΩ·cm。
离子交换的基本原理：
采用离子交换方法，可以把水中阳、阴离子去除。以氯化钠（NaCl）代表水中无机盐类，水质除盐的基本反应式：
1.阳离子交换柱：R-H+Na+=R–Na+H+
2.阴离子交换柱：R–OH+Cl-=R–Cl-+OH-
阳、阴离子交换柱串联以后称为复合床，其总的反应式：
R-H+R-OH+NaCl=R-Na+R-Cl+H2O
由此得出，水中的NaCl已分别被树脂上的H+和OH-所取代，而反应生成物为H2O，故达到了去除水中盐的作用。
离子交换设备工艺
1、预处理－反渗透－水箱－阳床－阴床－混合床－纯化水箱－纯水泵－紫外线杀菌器－精制混床－精密过滤器－用水对象
2、预处理－一级反渗透－加药机（PH调节）－中间水箱－二级反渗透－纯化水箱－纯水泵－紫外线杀菌器－0.2或0.5μm精密过滤器－用水对象
3、预处理－反渗透－中间水箱－水泵－EDI装置－纯化水箱－纯水泵－紫外线杀菌器－0.2或0.5μm精密过滤器－用水对象
离子交换设备应用领域：
1）水处理-离子交换设备
2） 食品工业
3） 制药行业
4） 合成化学和石油化学工业
5） 环境保护

Ⅵ 离子交换层析中流出物质顺序是什么

若用离子交换层析分离物质，以蛋白质为例，离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。

由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。

反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。

(6)阴阳离子交换层析纯化水实验扩展阅读：

对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。

溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。

梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物的过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。

Ⅶ 离子交换层析法原理是什么

离子交换层析法 （ion exchange chromatography，简称IEC）是从复杂的混合物中，分离性质相似大分子的方法之一，依据的原理是物质的酸碱性、极性，也就是所带阴阳离子的不同。电荷不同的物质，对管柱上的离子交换剂有不同的亲和力，改变冲洗液的离子强度和pH值，物质就能依次从层析柱中分离出来。
离子交换层析法大致分为5个步骤：
1. 离子扩散到树脂表面。
2. 离子通过树脂扩散到交换位置。
3. 在交换位置进行离子交换；被交换的分子所带电荷愈多，它与树脂的结合愈紧密，也就愈不容易被其它离子取代。
4. 被交换的离子扩散到树脂表面。
5. 冲洗液通过，被交换的离子扩散到外部溶液中。
离子交换树脂的交换反应是可逆的，遵循化学平衡的规律，定量的混合物通过管柱时，离子不断被交换，浓度逐渐降低，几乎全部都能被吸附在树脂上；在冲洗的过程中，由于连续添加新的交换溶液，所以会朝正反应方向移动，因而可以把树脂上的离子冲洗下来。
如果被纯化的物质是氨基酸类的分子，则分子上的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的pH值，所以当溶液的pH 值较低，氨基酸分子带正电荷，它将结合到强酸性的阳离子交换树脂上；随着通过的缓冲液pH逐渐增加，氨基酸将逐渐失去正电荷，结合力减弱，最后被洗下来。由于不同的氨基酸等电点不同，这些氨基酸将依次被洗出，最先被洗出的是酸性氨基酸，如apartic acid和glutamic acid（在约pH3~4时），随后是中性氨基酸，如glycine和alanine。碱性氨基酸如arginine和lysine在pH值很高的缓冲液中仍带有正电荷，因此这些在约pH值高达10~11时才出现。

Ⅷ 离子交换层析与疏水层析有何区别

离子交来换层析是利用蛋白自质在不同PH带不同种电荷的方法，利用离子交换的方法分离蛋白的。离子交换内的介质一般是树脂，阳离子交换型的，使用前树脂先用碱处理成钠型，将氨基酸混合液（pH=2-3)上柱，pH=2-3时，氨基酸主要以阳离子形式存在，与树脂上的钠离子发生交换而被“挂”在树脂上，再用洗脱剂洗脱。不同的氨基酸（带的电荷不同）与树脂的亲和力不同，要将其分离洗脱下来，需要降低它们之间的亲和力，方法是逐步提高洗脱剂的pH和盐浓度，这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来，反之亦然。不同反荷离子与树脂亲和力是不同的，其强弱关系为阳性竞争离子：Ag+〉CS+〉K+〉NH4+〉Na+〉H+〉Li+阴性竞争离子：I->NO3->(PO4)3->CN-〉HSO3-〉Mg2+〉HCO3-〉HCOO-〉CH3COO-〉OH-〉F-如果某种离子溶液洗脱效果不好，可用另一种亲和力强的离子代替之，等电点＞7选择阳离子交换树脂，等电点＜7选择阴离子交换树脂。

Ⅸ 离子交换法制备纯水的实验中阴阳离子交换树脂为什么在交换前要分别用酸碱处理，并洗至中性

这个设备中，存在阳离子树脂+惰性树脂+阴离子树脂

阴阳离子树脂在出厂时是处在失效状态，因此要先用酸碱分别将两种树脂激活才能正常使用

Ⅹ 离子交换柱层析能分离纯化蔗糖酶的主要依据是什么

DEAE-纤维素抄为二乙氨乙基纤维素，是阴离子交换剂。
其原理基于离子交换层析：离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。
由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。