已溶于水的DNA怎么在纯化

❶ DNA的分离和纯化的问题！！请教！！

氯仿除去蛋白：氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。加入异戊醇能降低分子表面张力，能减少抽提过程中的泡沫产生。同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。
加预冷的乙醇：冷的乙醇沉淀能力更强。乙醇沉淀DNA的机理是，DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。
SDS：SDS只是阳离子表活性剂，是蛋白质，特别是膜蛋白的变性剂。在基因组DNA提取中，SDS只是起破碎细胞游离核酸的作用，无法使DNA与蛋白质分离的。只有在碱裂解法提取质粒DNA，通过高盐（醋酸钾或醋酸钠）及低pH（4.5左右）中和下，SDS会沉淀，SDS沉淀过程中使得变性的DNA共沉淀，而经过中和复性的质粒DNA则不会沉淀，再通过离心即可把质粒DNA与基因组DNA及蛋白质分离。
RNase是RNA酶，能特定消化RNA，而不是蛋白质。
核酸分子（DNA或RNA）由于含有嘌吟环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm 处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值的比值（A260/A280）估计核酸的纯度，纯的DNA制品的比值为1.8，RNA的比值为2.0, 若DNA高于1.8,则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。
现在试剂盒是很普及的，使用试剂盒基本上不再需要酚，氯仿等有机溶剂。国内很多厂家都有产，本人使用过广州捷倍斯生物产的感觉就很不错。

❷ dna产物纯化试剂盒可以纯化甲基化之后的dna吗

dna产物纯化试剂盒可以纯化甲基化之后的dna
1、DNA提取问题：现在核算提取试剂盒大版部分都是吸附柱法权,相信你应该不会操作错误,如果提取之后进行核酸定量结果很低的话,试着再最后一步溶解核算的时候把水稍微加温（37℃就可以了）,溶解时间稍微长一些,然后再离心的时候采用分次离心,比如开始你用200ul溶解的话,你可以分两次用100ul水溶解离心,这样可以提高DNA的产率.
2、电泳问题：如果你核酸定量浓度不低的话就考虑电泳问题,电泳的时候加上1kb的marker,如果marker跑不出来说明你凝胶有问题,一般只要marker跑出来了,DNA浓度又比较高,而没有条带这样的现象很少见,DNA提取比较简单而且相当稳定,本人当时做甲基化提取的DNA有一次拿出来电泳忘了放回冰箱了,结果大夏天的在外面放了一天,心怀忐忑的进行了一次电泳,结果条带依然给力,一点都没有降解.

❸ DNA,纯化,表达,连接.

DNA 纯化
在生物技术实验中，我们粗提取的DNA需分离纯化去处蛋白质等杂质，我们都需要将最终的结果在琼脂糖凝胶， 或PAGE凝胶上走电泳观察，以判断我们实验的正确性以及DNA片段的完整性。同时通过紫外分光光度计测定OD260,OD280的吸收值，以确定DNA的浓度和纯度。
核酸经凝胶电泳后，在EB（溴化乙锭）中浸染，核酸分子与溴化乙锭结合后， 能吸收300-360mm波长的紫外光，同时诱发出液长为590nm的红橙色荧光，从而可通过照像机摄影，凝胶成像系统记录实验结果。DNA浓度的计算根据郎伯-比尔定理（E=abc）计算。根据经验1OD260=0.05ug/ul DNA。DNA纯度的判断根据OD260/OD280的比值判断，符合要求纯度高的纯化DNA其OD260/OD280在1.6-1.8之间，低于此范围表明蛋白质含量超标，高于此范围表明样品中含有RNA。
实验试剂及器材
酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）
70％乙醇 TE buffer
RNase
琼脂糖
TBE电泳缓冲液
电泳设备
紫外分光光度计
凝胶成像系统
1. 加入RNase至终浓度10μg/ul 37℃反应1小时。
2. 加入酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）等体积各抽提2-3次，取上清。
3. 加入1/10倍体积3M NaAc(pH5.2)，2倍体积无水乙醇混匀，－20℃下10min-30min。
4. 15000rpm，离心10分钟。
5. DNA沉淀用 70％乙醇洗2次， 37℃烘干DNA（无乙醇）。
6. 100μl TE buffer溶解沉淀
7 取20ul DNA母液稀释至1000μl，在紫外分光光度计上测OD260,OD280。
8. 取10 ul DNA, 在 0.8％琼脂糖凝胶120伏，1-2小时电泳，
9. 在凝胶成像系统上记录和分析结果。

DNA 连接
DNA分子的体外连接就是在一定条件下， 由DNA连接酶催化两个双链DNA片段组邻的5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程， DNA分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。
带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中,但是在连接反应时,外源DNA和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。因此，必须仔细调整连接反应中两个DNA 的浓度，以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制载体DNA的自身环化。利用T4 DNA连接酶进行目的DNA和载体的体外连接反应，也就是在双链DNA 5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成新的共价键。如载体的两条链都带有5’磷酸（未脱磷），可形成4个新的磷酸二酯键；如载体DNA已脱磷，则只能形成2个新的磷酸二酯键，此时产生的重组DNA带有两个单链缺口，在导入感受态细胞后可被修复。
1、 不对称粘性末端：两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；外源DNA可以定向插入到载体中。
2、 对称性粘性末端；线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；外源DNA会以两个方向插入到载体中。
3、 平端：要求高浓度的DNA和连接酶；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；非重组克隆的背景较高 。
粘性末端连接：
实验试剂：
用适当的限制酶消化质粒和外源DNA。如有必要，可用凝胶电泳分离片段并（或）用碱性磷酸酶处理质粒DNA。通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化DNA，然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。
10×T4DNA连接酶buffer（该缓冲液应分装成小份，贮存于－20℃。）：200mMTris-HCl(pH7.6)；50mMMgCl2；50mM二硫苄糖醇；
500μl/ml BSA（可用可不用）
T4DNA连接酶
5mM ATP

实验步骤：
1、 在无菌Eppendorf管中加入以下溶液：
1) 10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1-1∶5），补足ddH2O 至8μl。
2) 轻轻混匀，稍加离心，于45℃水浴5分钟使重新退火的粘端解链， 迅速将混合物转入冰浴。
3) 加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位， 用ddH2O 补至10μl。
2、 盖上管盖，充分混匀，台式离心扣上离心5秒。
3、 12℃下过夜连接反应。
4、 反应结束后于－20℃保存。
5、 再设立两个对照反应，其中含有（1）只有质粒载体；（2）只有外源DNA片段。如果外源DNA量不足，每个连接反应可用50-100ng质粒DNA，并尽可能多加外源DNA，同时保持连接反应体积不超过10μl。可用至少3种不同方法来测定T4噬菌体DNA连接酶的活性。

注意事项：
1、 连接反应的温度：DNA连接酶的最适反应温度为37℃，但在此温度下， 粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是12℃过夜。
2、 DNA的平未端和粘性末端：由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。 二者连接效率不同。粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的。
3、 碱性磷酸酶处理质粒载体：为了提高连接效率，一般采取提高DNA的浓度，增加重组子比例。这样就会出现DNA自生连接问题， 为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其5’末端的磷酸基，防止环化， 通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。
4、 连接反应的检测：连接反应成功与否，最后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确定。
5、 如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效，可重新连接酶切后的λDNA。若连接成功，则说明有效。

原核表达
将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：
易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：
（1）选择标志的编码序列；
（2）可控转录的启动子；
（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；
（4）一个多限制酶切位点接头；
（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：
获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测

真核表达
异源蛋白质在细菌中表达是目前使用的主要的蛋白生产系统。大肠杆菌一直是最经济的系统之一。然而为了生产需要特异修饰、胞外分泌或有特异折叠需要的蛋白质，其他表达系统也是需要的。真核细胞在表达原核来源的基因、真核基因的cDNA拷贝或其他无内含子的基因时可能表现很多特异问题。富含AT的基因在很多真核细胞中表达时会遭遇很剧烈的障碍。主要的真核信号序列如 加poly-A的位点、酵母转录终止位点和真核mRNA去稳定序列都是富含AT的。内含子序列也趋向于富含AT，尽管他们有参与剪切过程的很特异的识别序列。虽然绝大多数原核基因没有剪切或聚腺苷过程，但这些真核过程需要的保守序列可能存在于原核基因中，因此当这些基因在真核细胞中表达时可能引起特异的问题。而且诸如哺乳动物和单子叶植物细胞的特异真核表达系统可能不能有效地表达无内含子的基因。
真核mRNA在离开细胞核进而在胞浆的核糖体上被翻译前需要特异的处理和修饰。这些过程包括去除内含子、5'端甲基化帽子形成和3'端加poly-A。内含子去除需要5'剪切位点、G75/G100U100A65AG65U保守序列、3'剪切位点、富含密啶NC66A100G100/G56保守序列和C72T98R77A100Y75保守序列。有效的加poly-A和mRNA剪切需要一个由两个部分组成的信号：加poly-A保守序列AAUAAA和在切割位点内的50个碱基的富含GT的序列。酵母真核转录终止序列（几个不同的富含AT序列,如含TTTTTATA，TATATA，TACATA，TAGTAGTA的一个38bp区域）被研究的最清楚。这些结果来自对酵母突变体CYCI mRNA的mRNA水平和相对长度的确定的实验。近期用in vivo质粒稳定性分析的研究结果证明：TATATA似乎和原始的38bp野生型区域一样有效地终止转录，而TAGATATATATGTAA和TACATA效率差些，TTTTTTTATA几乎没有效率。所有这些序列在反方向时没有终止转录功能。不幸的是几乎没有其他真核表达系统转录终止序列方面的信息。
内含子对几个哺乳动物基因的正常表达是必需的，包括Beta-球蛋白、SV40 late mRNA和二氢叶酸还原酶基因。单子叶植物细胞充分表达乙醇脱氢酶的cDNA拷贝、报告基因氯霉素乙酰转移酶、Beta葡萄糖苷酸酶和其他缺乏内含子的基因时也依赖内含子。转录区域内引入内含子可以通过未确定的转录后机制增强表达。（免疫球蛋白基因）内含子可能也包含转录增强子，因此通过转录机制增强表达。

❹ 乙醇在核酸纯化中的作用

洗涤沉淀啊
主要是盐离子的去除
达到纯化DNA的目的

❺ 纯化dna的方法有哪些

纯化DNA的常用方法是用酚抽提-乙醇沉淀法，适用于普通实验室操作。它通过交替使用苯酚、氯仿两种不同的蛋白质变性剂，可以增加去除蛋白质杂质的效果；氯仿可以去除核酸溶液中的微量酚，还可以加快有机相与液相混合，去除色素和蔗糖；在氯仿中加入少量的异戊醇可以减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。
【实验材料】
待纯化的DNA溶液。
【实验仪器】
高压灭菌锅，涡旋混匀器，台式高速冷冻离心机
【试剂配制】
1、Tris饱和酚（pH8.0）：氯仿：异戊醇混合液
酚：氯仿：异戊醇按体积比25：24：1配制，现配现用。
2、氯仿：异戊醇混合液
氯仿：异戊醇按体积比24：1配制，现配现用。
3、醋酸钠溶液
配制3 mol／L的醋酸钠溶液，调节pH值至5.2。
4、TE缓冲液
10 mmol／L Tris·HCl（pH 8.0），1 mmol／LEDTA（pH 8.0），配制完成后高压灭菌，4 ℃保存。
【实验步骤】
1、在待纯化的DNA溶液中加等体积的酚：氯仿：异戊醇混合液，然后在涡旋混匀器上充分混匀。
2、将混合物12000 r／min离心10 min后，移取上层含DNA的水相到另一离心管中。如果在水相和有机相交界处有白色沉淀物，则需要重新抽提水相，直到两相交界处无明显沉淀物。
3、向上层水相中加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）混合液，在涡旋混匀器上充分混匀后12000 r／min离心10 min。
4、移取上层含DNA的水相到另一离心管中，加1／10体积的醋酸钠溶液，充分混匀，再向管中加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，上下倒置混匀，于-20 ℃保存30 min。
5、12000 r/min离心5 min，弃上清液；75%的乙醇12000 r/min离心洗涤5 min，弃上清液；用吸头将管壁残留的乙醇去除，室温干燥10-15 min（不要等DNA沉淀完全干燥，否则DNA不易溶解）。
~ 1 / 2 ~
6、在盛有干燥DNA的离心管中加入适量TE缓冲液，溶解后在-20 ℃以下长期保存。

❻ 纯化得到的DNA还能PCR吗 如何图稿DNA浓度

一，可以pcr。纯化的本质是去除蛋白质和一些其他物质，使你的dna纯度更高，所以当然内可以pcr，而且有的容时候由于dna不纯，甚至会干扰pcr。
二，纯化的时候会损失一些dna，只能说纯度提高，但是本质上dna含量会减少，至于浓度在于你溶解dna的液体体积吧~~~
三，至于提的dna浓度不高，一般在于自己的操作（如果同样情况下，别人可以提好），也有可能是因为材料的特殊性等，可以考虑试剂盒

❼ 怎样将dna与rna分离纯化

盐析法
DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同 利用这一特点 选择适当的盐浓度版就能使DNA充分溶解 而使杂质沉淀 或者相反 以达到分离目的 DNA在NaCl溶液中的溶权解度先增大后减小 在DNA溶解度最低时 DNA从溶液中析出 而其他杂质还留在溶液中 达到粗提取的目的
酶水解法
采用RNase（可以买）水解杂质RNA如果混入DNase酶可以采用100度加热15min使其失活 RNase不会失活 反之采用DNase可以提取RNA 混了RNase、时加入蛋白酶K或加碘乙酸钠

楼主别忘加满意，祝你生活愉快！

❽ 已经溶解于无菌水的DNA怎么再次纯化

加入ctab缓冲液，调节溶液为低盐然后离心，用高盐溶液溶解离心管底部沉淀，加入ctab沉淀液加入乙醇，离心，倒掉上清液搞定

❾ dna纯化试剂盒是不是可以用于浓缩

洗脱液复少加点就是浓缩；如果制是抽提好的DNA，可以溶解后再用异丙醇沉淀出来，过柱子-洗涤-少加洗脱液-离心（没试过，理论上感觉可以），或者异丙醇沉淀后直接离心-洗涤-风干（不要太干）-溶解；过程中会有损失，自己酌情考虑。

❿ 如何纯化pcr产物或粗提的dna

你是指跑胶、割胶然后用试剂盒纯化回收吗?
如果是的话,有以下几个方法可能专可以提高属回收率.
1凝胶要充分溶解.2加elution buffer溶解DNA时少加点.3用elution buffer洗脱时可以把管子里的溶液吸回来,重复一次.4溶解时延长室温溶解时间.5PCR循环可以多几次.6可以把两管回收离心后,合并成一管吸附柱回收.