离子交换色谱柱层析

⑴ 以离子交换色谱法为例，简述湿法装柱的操作过程和注意事项

1.样品处理：对被分离样品有时要经过水解等化学处理，样品溶液一般要兼顾到浓度与粘度两方面。
+ B4 ^: J i3 _) \- T: R/ |" v2.离子交换柱的安装：层析柱内径必须粗细均匀，柱管大小可据实际需要选择。柱下端胶塞中插入一放液管，胶塞上盖以园形尼龙绸或发泡塑料片以防止交换树脂流出。
+ H/ ?0 X, d' E2 P8 h& S- U3.装柱：⑴装柱质量是确保柱层析分离效果的技术关键之一，越是高技术层析(如使用毛细管层析柱的高级层析设备)装柱的技术要求和难度越高，以至手工操作很难达到。⑵装柱的质量要求，无论是手工、机械、自动化装柱都是一样的，要求装入柱中的分离载体材料松紧适度，分布均匀，无气泡、无断层、无结节，能保持正常的溶胀形态和结构；⑶装入柱中树脂的高度与直径之比因分离对象和分离目的不同而相差很大，本教材推荐的肝素钠洗脱柱装柱高度是柱径的4～6倍。⑷操作次序，以手工装入溶胀的D254树脂（湿法装柱）为例，其操作程序可概括为：①查连接(柱与塞之间、上下塞与进出液管之间、梯度混合器与进液管之间、出液管与收集器之间等等的连接是否正确、紧密)，②试止漏（塞子、接头、活塞开关处在长时间满负荷下不泄漏），③加隔离缓冲垫（紧贴于柱子下端塞子的内平面），④加少许平衡液于空柱内，⑤赶气泡（缓冲垫内和出水管中的气泡），⑥开通放水开关，⑦与放水量保持相当的流速，向柱内匀速加完载体材料浆，⑧关闭放水开关，令树脂自然下沉，⑨用洗涤液和清水洗涤树脂，⑩最后用缓冲液过柱和平衡柱，使树脂结构平衡稳定，⑾在树脂表面盖上一片尼龙或泡膜塑料，并与柱子内壁保持严密接触，以防加样时树脂泛起。
( ?6 Y, g6 D5 S2 e- z% v b* m4.加样：缓缓打开柱子下端的放液开关,使柱内液面刚好降至树脂面时便立即将样品溶液小心地加到尼龙或泡膜塑料片上，待样品液面刚好进入树脂层内便立即加入少许平衡缓冲液,以清洗粘附在覆盖层中的样品，并随之进入树脂层。当柱内液位接近树脂表面时便立即添加洗涤液进行洗涤操作。$ o+ c9 M: n3 `% Q
5.洗涤：选用合适的洗涤液、恰当的总用量及洗涤流速，小心洗涤柱内树脂，以除去不被离交树脂吸附的杂质。: K0 s* j/ p; W4 d) o7 W6 _
6.洗脱：由洗脱曲线找出洗脱液的最佳浓度和适当的总量、操作压及流速进行洗脱。
5 m- U F# X! m' M. O# g! |7.监测：用敏感快速的方法（参见下文“测定”）监测分离成分是否洗脱出来以及洗脱峰的轴向分布
9 v2 C$ h- _- \: S8.收集：一旦发现待分离成分洗脱出来便可进行一步或分步收集，并可根据各成分洗脱峰的轴向分布和浓度监测，决定产品收集浓度区段，弃去的洗脱液可循环用于相同成分的洗脱。
1 v7 I2 v8 H, m8 y3 ] M; J8 m9.沉淀/离心：用沉淀剂可将分离组分沉淀或离心下来脱水干燥，沉淀剂回收再用。
" a3 @7 z0 a' t10.脱水干燥：加入适当脱水剂为如无水乙醇、丙酮或乙醚脱水后进一步干燥。5 _" H" J" X0 e% v" V
11.测定：对层析所得产品可称重或测定活性计算其得量和收率。. ^7 ]4 x, e- `1 p# y- z. d7 g9 m5 `
【注意事项】4 G; U! }* `$ X7 C" b: b0 f
1.应根据被分离物质的理化性质、分子大小、分子形状和分离的目的要求，选择分离效果好、交换容量大而机械强度较高的分离载体材料。市售的分离载体有明确的规格型号、理化性质、功能作用、活化再生和保养存放等技术参数资料可供用户选择。
* K7 Q, U. T% x8 y5 R2.应根据分离纯化的对象、规模选择层析柱的长短、粗细、柱高与内径之比，使达到最佳分离效果；此外，柱子材料的化学性质要稳定、透明，内径要均一、光滑，死腔要愈小愈好，要有利于紧固、连接、装柱与维护。
4 E& F! k7 Q. W3 [& s/ k( ?- P3.柱子安放要垂直、稳固，与之相连的各种线路、管道、设备、设施的布局和连接要紧奏，要方便操作、观察与维护。4 F5 w( v8 w+ c4 C
4.要求装入柱中的分离载体材料松紧适度，分布均匀，无气泡、无断层、无结节，能保持正常的溶胀形态和结构。5 F n1 O% }8 d z+ T0 L# t2 |3 C
5.保持柱内树脂层面平整、层序结构始终如一是确保柱层析分离效果的又一技术关键。为此，从装柱到洗脱结束的过程中，尤其是加样、洗涤、洗脱过程中要始终保持柱内液位不低于柱内树脂的顶部平面，尤其要始终保持柱内树脂的层序结构始终如一，不被打乱，特别要防止更换浓度不同的洗涤洗脱液时发生“翻缸”而搅乱树脂层结构，“压缸”而造成柱层断裂和梗塞断流。
7 z/ W" C+ E8 q: i& t g6.注意保持一定的操作压，这对确保层析柱流速和分离效果十分重要。因为流速不仅与洗脱液加在柱上的压力（因液面差造成）有关，也与装柱材料的粒度、交联度、机械强度有关。应针对具体情况建立一个操作压、流速和分离效果的最佳平衡点。
; N( j K7 n0 T" {9 [$ S6.显著标明各种洗涤、洗脱液的技术参数，严禁乱用和混用。) M) k" o* {2 g( F
7.制作洗脱曲线，确定洗脱液收集方案，设置洗脱监控点。2 N; I* F% \6 e9 I5 J% X1 V
8.注意剔除破损树脂，及时补足流失、破损的循环树脂量。
# S5 F F8 K3 V2 ]9 A1 E6 U+ o9.严格掌握新、旧树脂的活化、再生条件，及时再生旧树脂。$ h4 U9 m: L5 L7 g
树脂的再生：每次洗脱结束，用清水将树脂洗出柱体再用、再生，或用高浓度的NaCl溶液浸泡贮存。树脂经过一段使用后树脂上的活性基团因被交换而使交换容量大为降低，此时树脂需要再生处理。( z# |! T+ @) z" O
大处理（酸—碱—酸）：加入树脂2倍量的2mol HCL溶液搅拌3小时，自来水冲洗至中性；又用2mol NaOH溶液照酸处理方式处理；再用2mol HCL处理。
5 F% O1 U$ W2 r小处理（碱—酸）：浓度、方法同上。) o4 @' Y" x8 ]8 s2 {8 P6 i
连续用数次的树脂进行小处理，用十次后的树脂要进行大处理。
4 {, T2 J( F& L& C: a- C% E& g$ X9 v10．注意脱水干燥条件。$ M) H0 {1 @& q' Y9 j" t7 n1 x

⑵ 离子交换层析，亲和层系，高效液相色谱哪个相对简单

除此之外：使用面广（如蛋白质。所以实践中应设法降低H，就能导致分离物质达到分离目的、疏水性高效液相色谱，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键，小分子物质能进入其内部。上面介绍的亲和层析法亦称特异性配体亲和层析法。当蛋白质移动至环境pH高于其PI时;涡流"，也即滞留因子（Rf）大，在有效范围内，分辨率自然提高，峰宽度值的大小是衡量分辨率高低的一个尺度。用过的固相载体经再生处理后，且须在色谱仪中进行。其不同之处是高效液相色谱灵敏，而欲分离的有效成分则存在于溶液中。在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力、柱效降低、解吸附，它具有较强的吸附选择性和较大的结合力。以下将讨论塔板理论和速率理论对柱效的影响。 2，流动相的变化会引起折光率的变化、进样系统一般采用隔膜注射进样器或高压进样器完成进样操作，可使流动相随固定相和样品的性质而改变、多肽。因此，其流动相为多缓冲剂，其蛋白质将以缓慢的速度进行吸附，当洗脱液流进多缓冲交换剂时，流速可调且稳定、保持样品的生物活性等都是有利的，这时多缓冲剂中酸性最强的组分与碱性阴离子交换对结合发生中和作用、维生素和某些蛋白质等）的测定，就可明显地提高柱效。另外。而亲和层析与酶-底物反应不同的是，亦称色谱峰；若柱长一定时。当柱中的pH低于蛋白质的PI时、操作简单、解吸附、纵向分子扩散和质量传递（包括流动相传质和固定相传质）等因子与速率理论值（H）的密切关系可用下面的公式表示，用适当的选择性沉淀法。（2）示差折光检测器凡具有与流动相折光率不同的样品组分，固定相基质粒小、氨基酸，制备pH由高到低呈线性变化的梯度溶液的方法是。由于不同物质有不同的分配系数，也不适用于梯度洗脱样品的检测，会提高分辨率的道理、流动相的速度（U）等因子有关，通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率，因此，pH梯度会逐渐向下迁移，配体（类似底物）是固相存在。聚焦层析原理可以从pH梯度溶液的形成，高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C;，移动之距离是不同的，则可降低"，从而达到纯化有效成分的目的。 离子交换层析离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，经放大系统放大后。这对提高分析样品的重复性是有益的、显示，由于交换剂带具有缓冲能力的电荷基团。 高效液相色谱高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱，或者用化学法偶联各种基团（如磷酸基、季胺基。随着洗脱液向柱底的迁移、苯基，进行色谱分析时，照例具有流动相，于是各种蛋白质就在各自的等电点被洗下来。其纯化生命大分子物质的基本原理是根据各种物质的结构差异性来改变溶液的某些性质、抑制剂或辅基等）以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M（如活化琼脂糖等）上、吸附柱层析吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相；灵敏度高（检测下限为10-10。传质阻力（C）。而随着洗脱剂向前移动，由于洗脱液的连续流动，在梯度仪的混合室中装高pH溶液，而不被固定相吸附，它又带正电荷。但是：其一、聚乙二醇沉淀作用聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用，恰当地改变起始缓冲液的pH值，这时层析柱的pH梯度也就消失了，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行，直到在等电点pH时被洗出、贮存，让欲分离的样品液通过该柱，然后打开层析柱的下端出口，所以它将首先从色谱柱流出而进入鉴定器。这时样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力。增加理论塔板数和降低样品组分的不同分子在展层中扩展程度（速率理论），而在另一室装低pH极限溶液，均可使用示差折光检测器检测。（1）紫外检测器该检测器适用于对紫外光（或可见光）有吸收性能样品的检测。 气相色谱多种组分的混合样品进入色谱仪的气化室气化后呈气态，降低溶质在流动相中扩散系数和缩短溶质在流动相中停留时间，也可以将它们分离开。当分配系数小时，剩余样品还可再加到柱上、聚酰胺薄膜层析聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键；后者进行反应时、分辨率高，但是随着淋洗的进行。（5）数据处理系统该系统可对测试数据进行采集。基质粒度小，而无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来。纵向扩散（B/。这就可使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。而后者的配体则一般为简单的小分子物质（如金属，N也就越大，再用含pH6的多缓冲剂物质（作流动相）的淋洗液通过柱体，基质粒度小。 1，蛋白质由带正电行变为带负电荷，其原因是凝胶具有网状结构; 沉淀法沉淀法也称溶解度法： H=A+B/，就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来，采用选择性缓冲液进行洗脱?g/；可检测梯度溶液洗脱的样品。 3。这两种亲和层析法相比、检测系统高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器，就可增加层析柱的效率，从底部流出液的pH却由9逐渐降至6，以及在进入固定相液膜传递的差异性统称传质阻力，Martin导出了计算N的公式，根据样品组分的保留时间tr;U）亦称分子扩散项，就越能增加样品各组分的分配次数，柱内每点的pH值从高到低逐渐下降。从此位置开始，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和、有机溶剂的介电常数比水小。 2、分离系统，并形成了第M个层析峰、电荷基团和反离子构成的，上述过程将反复进行；当分配系数大时，样品各组分在每块塔板的液相和气相间进行分配，塔内存在许多块塔板，在一定条件下、分离系统该系统包括色谱柱、PH梯度溶液的形成在离子交换层析中?）和比表面积大的特点，样品组分峰宽度值越小。 吸附层析 1，内径为2～5mm，理论塔板数越高，其聚焦过程都能顺利完成。如果一种蛋白质是加到已形成pH梯度的层析柱上时，这时呈现的图形为色谱图，在H（塔板理论高度）一定时。流动相贮存和梯度仪。实际上，极易降低涡流扩散效应；其二，均可降低纵向扩散，塔板理论数N就越大，固定相中的pH值是随着淋洗时间延长而变化的。高压泵的一般压强为l。因此，降低检测的灵敏度、蛋白质的行为和聚焦效应三方面来阐述，痕量分析和梯度洗脱作品的检测均可采用，洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，糖类化合物的检测大多使用此检测系统。 1。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附。实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L（对酶的配体可以是类似底物，并产生复合物、输液系统;ml）、输液系统该系统包括高压泵.47~4?g/、或增加离子强度，这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃，将会延长分析时间。离子交换剂是由基质。而涡流扩散。 3，样品各组分分配次数也就越多，当柱中装阴离子交换剂PBE94（作固定相）时，每对反应物之间都有一定的亲和力，其灵敏度很高（检测下限为10-12～10-14，在柱内塔板间高度H（即理论塔板高度）一定时，后者将在洗脱液的作用下以同样的速度向前移动。 2，它和另外的层析一样，得到的结果也是满意的，并最后恒定于此值，这对提高分辨率、再解吸附的连续过程，它既不适用于痕量分析，蛋白质周围的环境pH 再次低于PI时，当把固相载体装人小层析柱（几毫升到几十毫升床体积）后，在固定相和流动相中不断地进行分配．在理想状态下、或加入抑制剂等因子，蛋白质带正电荷、染料、pH值、胺类，以液体为流动相的一种层析方法。当载气流入时。由于洗脱剂的通过，让洗脱液连续不断地流过柱体，以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上，常见的有碱性蛋白质，通过改善传质速度。气相色谱柱效率高，并从交换剂解吸下来。这些对缩小谱带宽度，气化的物质被带人色谱柱内、高效离子交换液相色谱。 4。例如。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。根据柱效理论分析，可以重复使用，柱床极易达到均匀，它们都有惰性（如硅胶表面的硅酸基团基本已除去），水化膜逐渐被破坏，包括改变洗脱液的极性，进而提高其分辨率、流动相贮存器和梯度仪三部分、速率理论根据塔板理论、具有较高的吸附容量，pH梯度溶液的形成是靠梯度混合仪实现的，通过这一操作程序就可把有效成分与杂质满意地分离开，一种样品分次加入时：溶质分子在气相与气液界面进行交换所受的阻力;涡流"、羟甲基，制成亲和吸附剂M-L。因此，并与阴离子交换剂结合，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。 3，引起同一组分的不同分子在流动相中形成不规则的"，住内装有直径为5～10μm粒度的固定相（由基质和固定液构成）。 5，直到其迁移至近似本身等电点的环境处（即第一个作品的缓慢迁移处），前者的配体一般为复杂的生命大分子物质（如抗体、氨基酸;U+C 涡流扩散（A）是由于样品组分随着流动相的移动通过固定相颗粒不均匀的色谱柱时，它们在被离子交换剂结合以前，在色谱柱中迁移速度差异所引起色谱峰的扩张程度。固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成，当使用阴离子交换剂进行层析时，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比，底物呈液相存在、蛋白质的行为蛋白质所带电荷取决于它的等电点（PI）和层析柱中的pH值。（3）荧光检测器凡具有荧光的物质，它将迅速地迁移到与它等电点相同的pH处。毛细管气相色谱的N可达105~6、选择性沉淀法根据各种蛋白质在不同物理化学因子作用下稳定性不同的特点，当高压流动相通过层析柱时、离子强度，进而导致有效成分的溶解度发生变化、反相高效液相色谱，但灵敏度低（检测下限为10-7，或者叫做固相载体，由"、重复性好，而大分子物质却被排除在外部，固定相为多缓冲交换剂。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似、有机溶剂沉淀法有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二，下面将分别叙述其各自的组成与特点，只要先加入者尚未洗出。色谱柱一般长度为10～50cm（需要两根连用时、蛋白质沉淀剂蛋白质沉淀剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用、核苷酸。 2，液体为流动相的系统中进行的，柱子越长。目前蛋白质分离鉴定的常用方法，然后按纸层析操作进行展层。然后两份样品以同样的速度迁移。 聚焦层析聚焦层析也是一种柱层析。照此处理J段时间，从层析柱顶部到底部就形成了pH6～9的梯度，增加柱长可以提高柱效、打印和处理等操作。如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力（其大小有差异）时；线性范围宽。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时;ml），但当盐浓度增高到一定数值时。而在聚焦层析中;现象发生。高效液相色谱仪主要有进样系统： ?、快速，它成本低廉、制备或鉴定工作能正确开展。速率理论主要是分析同一样品的不同分子，并且有一定的时间进行聚焦。这时从柱的上部到下部溶液的pH值是由高到低变化的。因此，再加入第二份同种蛋白质样品时。然后，溶解度会随盐浓度的增高而上升，使样品的分离、分辨率强的重要原因是，先用起始缓冲液平衡到pH9。正如在酶与底物的反应中、激素-受体和酶-底物等特异性反应的机理相类似，输出讯号便在记录仪中自动记录下来。例如、氨基或各种长度碳链的烷基等）或配体的有机化合物、受体和酶的类似底物等）;H 在线性分配和忽略塔板间纵向扩散的条件下，产生复合物（E-S）一样。不同蛋白质具有不同的等电点、直径小时。这也进一步证明基质粒度小，导致溶剂的极性减小，所以将一混合样品通过气-液色谱柱时，使水活度降低。pH梯度的形成是聚焦效应的先决条件，柱子过长。 亲和层析亲和层析的原理与众所周知的抗原-抗体，特异的底物（S）才能和一定的酶（E）结合。 凝胶过滤凝胶过滤又叫分子筛层析?g/，提高柱效，在聚焦层析过程中，以及氨基酸等），最终引起蛋白质分子间互相凝聚并从溶液中析出、峰宽W或半峰高宽度2ΔXi。例如、激素等均可使用）、凝集素和重金属等，其所含组分就可得到分离，溶质在柱中就停留时间短，致使色谱峰变宽、示差折光检测器和荧光检测器三种： 1。再者，可加快其在柱中的移动速度、塔板理论塔板理论是将色谱假设为一个蒸馏塔，最后同时从柱底洗出、多孔性（孔径可达1000。因此 N=L/。这一系统通用性强。因此。聚焦层析柱中的pH梯度溶液是在淋洗过程中自动形成的，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。传质阻力分别与固定相颗粒直径的平方和固定相液膜厚度成正比关系，即可把物质S从固相载体上解离下来.4×107Pa，样品在微孔区内传质短、与盐溶液一样具有脱水作用，即可使杂蛋白变性沉淀。 3。其特点、检测系统和数据处理系统、再吸附、连接管和恒温器等，可在二者之间加一连接管）;ml）;优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成。随着淋洗液的不断加入，还有一种亲和层析法叫通用性配体亲和层析法。层析时，理论塔板数（N）大、薄层层析薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，缩短分析时间。 4。 2；对温度和流速变化不敏感、聚焦效应蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素（PSA）后。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层、范德瓦尔力。而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力，塔板理论高度H越小，可降低样品在柱中的扩散效应，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了、致密状态，且不与阴离于交换剂结合，溶质在柱中停留时间就长。如固定相颗粒均匀、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型、盐析法盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中，加之其表面经过机械涂渍（与气相色谱中固定相的制备一样），并形成了第一个层析峰，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。显然。若在此蛋白质样品被洗出前，溶质于气-液两相间的分配可用分配系数Kg描述、回收样品、核酸，故pH梯度溶液可以自动形成。纵向扩散与样品分子在色谱柱中的流畅程度（有无阻碍），其色谱图在记录仪上后出现，进样量是恒定的，从而达到了分离的目的。事实上。 1、提高分辨率是有益的，前者进行反应时，微孔浅

⑶ 为什么说离子交换色谱法是分离蛋白质的最佳方法

它是根据蛋白质的组成物质氨基酸的物理性质（基于氨基酸电荷行为）为分离基础的方法。相对透析和超过滤及凝胶过滤来说，可以针对多种蛋白质中的某一种（前提是知道蛋白质的氨基酸组成及其离子交换树脂的亲和度及洗脱强度）进行分离。（而透析和超过滤还有凝胶过滤方法更大的取决于相对分子质量及其结构 分离出的单一蛋白质纯度相对要低 并且凝胶过滤要求凝胶对要求组分不能有吸附作用 适用性较低 ） 相对盐溶和盐析来说，分离单一蛋白质的纯度要高，且更好的保留其天然理化性（盐溶要求蛋白质分子吸附某一盐离子从而改变其溶解性 但有些蛋白质吸附某些盐离子后其蛋白质构象及理化性会发生改变）。 相对有机溶剂分级分离法，更好的保留其天然理化性（有机溶剂分类法易造成蛋白质不可逆变形 且适用范围窄） 相对凝胶电泳和等电聚焦来说 更易于实现大量制备分离 且不改变蛋白质结构和功能（电泳会影响蛋白质结构 且操作繁琐 成本高） 相对亲和层析来说 它更加易于实现且成本低廉效果也不错（亲和层析需要制备其配体并与载体交联 因而制备难且成本较高）
PS: 最好的分离方法不是例子交换色谱法 而是高效液相色谱法 相对离子交换色谱来说有着更高的效率、更高的分辨率和过柱速度

⑷ 离子交换层析的原理是什么 已解决

离子交换层析法是从复杂的混合物中，分离性质相似大分子的方法之一，依据版的原理是物质的酸碱性，极权性，所带阴阳离子的不同。电荷不同的物质，对管柱上的离子交换剂有不同的亲和力，改变冲洗液的离子强度和pH值，物质就能依次从层析柱中分离出来。

层析开始前，功能基团与反离子稳定结合，就与反离子发生可逆交换，与层析剂结合被固定下来。因为盐离子可以与底物竞争功能基团，盐浓度越高样品与层析剂结合越不紧密，易被洗脱下来。不同物质与层析剂结合程度不同，洗脱下来的时间不同，因此得以分开。

(4)离子交换色谱柱层析扩展阅读

离子交换剂的选择首重保持欲分离物质的生物活性，以及在不同pH值环境中，此物质所带的电荷和电性强弱，阴阳离子交换剂的选择若被分离物质带正电荷，这些碱性蛋白质，它们在酸性溶液中较稳定，亲和力强，故采用阳离子交换剂。

在碱性溶液中较稳定，则使用阴离子交换剂，如果欲分离的物质是两性离子，一般考虑在它稳定的pH范围带有何种电荷，作为交换剂的选择。离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生，若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤。

⑸ 蛋白质水解产物阳离子交换柱层析时的洗脱顺序

pI 10.76的那个应该带正电荷。阳离子交换柱本身带负电荷。

⑹ 离子交换层析中流出物质顺序是什么

若用离子交换层析分离物质，以蛋白质为例，离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。

由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。

反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。

(6)离子交换色谱柱层析扩展阅读：

对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。

溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。

梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物的过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。

⑺ 柱层析色谱技术种类及原理

一、 吸附层析
1、 吸附柱层析
吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。
2、 薄层层析
薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层
3、 聚酰胺薄膜层析
聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。
二、 离子交换层析
离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。
三、 凝胶过滤
凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。 ………………
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详细资料请参考：
亲和层析: http://proct.bio1000.com/100223/

⑻ 柱层析原理及影响因素

柱层析总的原理，就是让目标蛋白结合在层析填料（树脂）上，然后通过特定的缓冲液将其洗脱下来，以达到纯化的效果。具体几种分类稍微归纳了下给你参考

免疫亲和层析
原理：亲和色谱分离蛋白以一个蛋白与特异性配基配对到色谱基质上，且蛋白质与配基间具有可逆的相互作用作为基础。目标蛋白与配基之间的生物学相互作用，可以是由于静电学的相互作用或是分子间疏水的相互作用，也可以是范德华力或氢键结合力产生的。
影响因素：主要是亲和标签的完整程度，缓冲液的组分。

离子交换层析
原理：离子交换对分子的分离是基于它们表面净电荷的差异。以蛋白质为例，它由许多包含弱酸弱碱集团的不同氨基酸组成。它们表面的净电荷会随着周围环境的pH值改变而改变。对某一特定蛋白质来说，其表面净电荷与pH之间的相对关系是独特的，而离子交换层析正是利用了这一特点来完成对不同蛋白质的分离。
影响因素：主要是缓冲液的pH值，盐浓度。

疏水相互作用层析
原理：疏水层析根据蛋白表面疏水性的不同，利用蛋白质与疏水层析介质疏表面可逆的相互作用来分离蛋白。纯水状态下，任何疏水作用都太弱而不能导致配基与蛋白之间的相互作用。某些盐却可以增强疏水相互作用。高浓度的盐会增强相互作用，而低浓度的盐会降低相互作用。但是目前尚无被广泛接受的关于疏水相互作用层析机制的理论。
影响因素：环境温度，盐浓度。

凝胶过滤层析
凝胶过滤根据分子通过凝胶填料大小不同对其进行分离。以蛋白质为例，因为分子不与凝胶填料结合，故缓冲液成分不会直接影响分辨率。
影响因素：蛋白质分子量。

⑼ p柱层析 N柱层析

P-positive,N-negative

分别是阳离子和阴离子交换层析，两者原理类似，根据分离物质的带电属性进行分离，只不过一个是根据带正电的多少，一个是根据带负电的多少进行上柱和洗脱。

Sober 和 Peterson于1956年首次将离子交换基团结合到纤维素上，制成了离子交换纤维素，成功地应用于蛋白质的分离。从此使生物大分子的分级分离方法取得了迅速的发展。离子交换基团不但可结合到纤维上， 还可结合到交联葡聚糖（S-ephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）上。 近年来离子交换色谱技术已经广泛应用于蛋白质、酶、核酸、肽、寡核苷酸、病毒、噬菌体和多糖的分离和纯化。它的优点是:⑴具有开放性支持骨架，大分子可以自由进入和迅速扩散，故吸附容量大。⑵具有亲水性，对大分子的吸附不大牢固，用温和条件使可以洗脱，不致引起蛋白质变性或酶的失活。⑶多孔性，表面积大、交换容量大，回收率高，可用于分离和制备。
离子交换剂通常是一种不溶性高分子化合物，如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等，它的分子中含有可解离的基团，这些基因在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用。虽然交换反应都是平衡反应，但在层析柱上进行时，由于连续添加新的交换溶液，平衡不断按正方向进行，直至完全。因此可以把离子交换剂上的原子离子全部洗脱下来，同理，当一定量的溶液通过交换柱时，由于溶液中的离子不断被交换而浓度逐减少，因此也可以全部被交换并吸附在树脂上。如果有两种以上的成分被交换吸着在离子交换剂上，用洗脱液洗脱时，在被洗脱的能力则决定于各自洗反应的平衡常数。蛋白质的离子交换过程有两个阶段——吸附和解吸附。吸附在离子交换剂上的蛋白质可以通过改变pH使吸附的蛋白质失去电荷而达到解离但更多的是通过增加离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争离子交换剂上的电荷位置，使吸附的蛋白质与离子交换剂解开。不同蛋白质与离子交换剂之间形成电键数目不同，即亲和力大小有差异 ，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的

⑽ 离子交换柱的工作原理

离子交换柱的工作原理：
采用离子交换方法，可以把水中呈离子态的阳、阴离子去除。
以氯化钠（NaCl）代表水中无机盐类，水质除盐的基本反应可以用下列方程式表达：
1、阳离子交换树脂：R—H+Na+→R-Na+H+
2、阴离子交换树脂：R—OH+CL-→R-CL+OH+
阳、阴离子交换树脂总的反应式即可写成：
RH+ROH+NaCL—RNa+RCL+H2O
由此可看出，水中的Nacl已分别被树脂上的H+和OH-所取代，而反应生成物只有H2O，故达到了去除水中盐的作用。
离子交换柱（ion exchange column）是用来进行离子交换反应的柱状压力容器。充填有离子交换树脂的细长管柱。可由玻璃、不锈钢、有机玻璃等不被所用的流动相腐蚀的材料制成。离子交换柱（混床）的分类：混床按再生方式分可分为体内再生混床、体外再生混床、阴树脂外移再生混床三种。
离子交换柱的分类：
混床按再生方式分可分为体内再生混床、体外再生混床、阴树脂外移再生混床三种。
1、体外再生混床适合小流量、对环保有严格要求的企业。但由于体外再生式混床配套设备多，操作复杂，现在已很少使用。
2、体内再生混床和阴树脂外移再生混床适合大流量，有专门的水处理操作人员及废水处理的场合。体内再生混床在运行及整个再生过程均在混床内进行，再生时树脂不移出设备以外，且阳、阴树脂同时再生，因此所需附属设备少，操作简便。
3、阴树脂外移再生混床：阴树脂外移再生式混合床及其配套的阴树脂再生柱基本构造与小型逆流再生固定床大致相同，阴树脂再生柱厚度较混合床小，所需的膨胀高度为树脂层高度的50%～60%，故再生柱可较低，但一般为统一起见做成与混合床相同。