凝胶过滤
⑴ 影响凝胶过滤分离效果的有哪些因素,为什么
(1)层析柱的选择
层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。一般来讲,主要是层析柱的长度对分辨率影响较大,长的层析柱分辨率要比短的高;但层析柱长度不能过长,否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。一般柱长度不超过100cm,为得到高分辨率,可以将柱子串联使用。层析柱的直径和长度比一般在1:25-1:100之间。用于分组分离的凝胶柱,如脱盐柱由于对分辨率要求较低,所以一般比较短。
(2)凝胶柱的鉴定
凝胶柱的填装情况将直接影响分离效果,关于填装的方法前面已有介绍,这里主要介绍对填装好的凝胶柱的鉴定。凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。另外通常可以采用一种有色的物质,如蓝色葡聚糖-2000、血红蛋白等上柱,观察有色区带在柱中的洗脱行为以检测凝胶柱的均匀程度。如果色带狭窄、平整、均匀下降,则表明柱中的凝胶填装情况较好,可以使用;如果色带弥散、歪曲,则需重新装柱。另外值得一提的是,有时为了防止新凝胶柱对样品的吸附,可以用一些物质预先过柱,以消除吸附。
(3)洗脱液的选择
由于凝胶层析的分离原理是分子筛作用,它不象其它层析分离方式主要依赖于溶剂强度和选择性的改变来进行分离,在凝胶层析中流动相只是起运载工具的作用,一般不依赖于流动相性质和组成的改变来提高分辨率,改变洗脱液的主要目的是为了消除组分与固定相的吸附等相互作用,所以和其它层析方法相比,凝胶层析洗脱液的选择不那么严格。由于凝胶层析的分离机理简单以及凝胶稳定工作的pH 范围较广,所以洗脱液的选择主要取决于待分离样品,一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析。为了防止凝胶可能有吸附作用,一般洗脱液都含有一定浓度的盐。
(4)加样量
关于加样前面已经有所介绍,要尽量快速、均匀。另外加样量对实验结果也可能造成较大的影响,加样过多,会造成洗脱峰的重叠,影响分离效果;加样过少,提纯后各组分量少、浓度较低,实验效率低。加样量的多少要根据具体的实验要求而定:凝胶柱较大,当然加样量就可以较大;样品中各组分分子量差异较大,加样量也可以较大;一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1%-5%左右,而分组分离时加样体积可以较大,一般约为凝胶柱床体积的10%-25%。如果有条件可以首先以较小的加样量先进行一次分析,根据洗脱峰的情况来选择合适的加样量。设要分离的两个组分的洗脱体积分别为Ve1和Ve2,那么加样量不能超过(Ve1-Ve2)。实际由于样品扩散,所以加样量应小于这个值。
从洗脱峰上看,如果所要的各个组分的洗脱峰分得很开,为了提高效率,可以适当增加加样量;如果各个组分的洗脱峰只是刚好分开或没有完全分开,则不能再加大加样量,甚至要减小加样量。另外加样前要注意,样品中的不溶物必须在上样前去掉,以免污染凝胶柱。样品的粘度不能过大,否则会影响分离效果。
(5)洗脱速度
洗脱速度也会影响凝胶层析的分离效果,一般洗脱速度要恒定而且合适。保持洗脱速度恒定通常有两种方法,一种是使用恒流泵,另一种是恒压重力洗脱。洗脱速度取决于很多因素,包括柱长、凝胶种类、颗粒大小等,一般来讲,洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平衡,分离效果好。但洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽,反而会降低分辨率,而且实验时间会大大延长;所以实验中应根据实际情况来选择合适的洗脱速度,可以通过进行预备实验来选择洗脱速度。一般凝胶的流速是2-10 cm/hr,市售的凝胶一般会提供一个建议流速,可供参考。总之,凝胶层析的各种条件,包括凝胶类型、层析柱大小、洗脱液、上样量、洗脱速度等等,都要根据具体的实验要求来选择。例如样品中各个组分差异较小,则实验要求凝胶层析要有较高的分辨率,提高分辨率的选择应主要包括:选择包括各个待分离组分但分离范围尽量小一些的凝胶,选择颗粒小的凝胶,选择分辨率高的凝胶类型,选择较长、直径较大的层析柱、减少加样量、降低洗脱速度等等。
⑵ 凝胶过滤分离大分子物质的机理是什么
答案A 用凝胶过滤柱层析分离蛋白质是根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法回答,与蛋白质分子的带电状况无关.在进行凝胶过滤柱层析过程中,比凝胶网眼大的分子不能进入网眼内,被排阻在凝胶颗粒之外.比凝胶网眼小的颗粒可以进入网眼内,分子越小进入网眼的机会越多,因此不同大小的分子通过凝胶层析柱时所经的路程距离不同,大分子物质经过的距离短而先被洗出,小分子物质经过的距离长,后被洗脱,从而使蛋白质得到分离.
⑶ 凝胶过滤色谱 与凝胶渗透色谱的区别是什么
凝胶色谱以水为流动相的称作凝胶过滤色谱,以有机溶剂为流动相的,称作凝胶渗透色谱。
⑷ 如何选择凝胶过滤填料
首先琼脂糖凝胶可以排除,这是大孔凝胶,用于分子量较大的成分。
我做分子筛用的比较多的柱回子都答是葡聚糖凝胶凝胶,我的蛋白比你的大,用g50和g100的填料,做的结果都没什么问题。
你的蛋白7kd,如果没有什么特别的性质(高级结构是球形还是其他的,有无多聚),g50应该可以。如果你不放心,也可以考虑聚丙烯酰胺凝胶,它和葡聚糖凝胶相比更适合于分子量稍小的蛋白,可能更实用于你的实验。
聚苯乙烯凝胶没用过,不发表意见。
⑸ 凝胶过滤方法有什么局限性
葡聚糖凝胶对蛋白质往往有不可逆的吸附性能,需先用易得到的蛋白质进行预层析,以便消除其影响(虽然吸附的数量较少,但是在制作测定蛋白质分子质量的标准曲线时,或者分离纯化极难得到的物质时,需预层析)。
⑹ 凝胶过滤的介质有哪些,各过滤介质的异同是什么
加油,首先,是这样的话
①粒状介质:如焦炭,石砾,细砂,锯屑,活性炭,玻璃渣,酸性白土等;常用于过滤固相含量较少的悬浮液,如水的过滤和糖的脱色等。
⑺ 凝胶过滤层析的基本原理是什么
凝胶过滤层析又称为排阻层析或分子筛方法。其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相(凝胶)具有分子筛的特点,将被分离物质各成分按分子大小分开,达到分离的目的。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质,多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质,小分子物质能进入其内部,流下时路程较长,而大分子物质却被排除在外部,下来的路程短,当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时,溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
⑻ 凝胶过滤法与sds
蛋白质的形状影响凝抄胶袭过滤时候的行为,分子形状长的蛋白质在凝胶过滤的时候有类似于分子较大的蛋白的行为,用SDS-PAGE测定的蛋白质分子量应该比较准确,因为变形后的蛋白质迁移速度只取决于蛋白质分子大小.
⑼ 凝胶过滤技术有哪些具体应用
凝胶过滤色来谱法:分辨率源较高,但是上样量仅为柱体积的1%,而且对流速也有严格的限制。离子交换色谱法:根据目的蛋白质表面所含有的氨基酸残基带有的净电荷分离蛋白质,但是分辨率没有凝胶过滤高。亲和层析法:根据生物分子的特异性分离目的蛋白,特异性很高,但是配件容易丢失适合含有特异性的标签的或者抗体。疏水色谱:根据疏水性来分离蛋白质,缺点是有的蛋白质在高盐中溶解度降低,所以应用范围受到限制,适合蛋白质表面含有较多疏水性氨基酸残基的疏水性蛋白质。