蛋白纯化浓缩换液超滤

A. 超滤浓缩蛋白溶液时其浓度该从高到低还是有低到高对超滤膜好呢

从低到高,当然首先3瓶中蛋白分子量应该差不多,否则先超滤小分子的,主要是减少超滤膜的堵塞程度

B. 蛋白用超滤管浓缩容易沉淀怎么办

可能是这个蛋白的水溶性较差，也就是只能保持在一定浓度不能太高
另外就内和这个蛋白容的稳定性有关了，超滤时保持低温，体积缩小一点后就把滤液混匀避免局部浓度过高，选择更合适的缓冲液，添加一点甘油等小分子物质等都可以增加蛋白的稳定性。

C. 【求助】超滤能否脱盐和浓缩一步完成啊

昨天有个millipore的技术人员就是这样说的~HarveyWang(站内联系TA)本人主要是从发酵液中提取酶,文献上一般的步骤是先用硫酸铵沉淀,然后透析,再用超滤浓缩,最后冷冻干燥, 这要看你需要做多大的体积了。:) (1)硫酸铵沉淀法：我的观点是，如果你1000 mL的发酵液的话，硫酸铵沉淀可以用，但是这浪费多少硫酸铵啊？！做学术研究可以，如果你的课题是计划做提取酶的工艺和中试的话，这种硫酸铵沉淀并不有太大的实用性。 （2）超滤步骤的选用要看你的酶溶液有多大的体积。 如果发酵液的酶的量并不是很浓的话，例如50 mL 10 mg/L的酶量，用这种超滤膜会损失掉大部分你的目地酶，都粘到膜上去了，很难洗下来（稀的NaOH可以）。不能轻信某品牌销售说的话，用用就知道了。如果你的浓缩液体积比较大，例如100-500 mL，酶的浓度也很高，这是可以用超滤膜的。 （3）对于小体积的脱盐透析，透析袋很好用的。这里是指10 mL-100 mL。从操作方便性上看，这个在小型试验中我最喜欢用。好简单啊。。。。 自己顶一个,解答的详细的有重奖!(金币可以再加) （1）发酵液的酶蛋白浓度大约是多少，纯度是多少？发个SDS-PAGE看看，注明上样量。 （2）硫酸铵沉淀后和透析后可上离子交换，这可以浓缩10-1000倍，还可以有纯化效果，然后再冷冻浓缩啊。HarveyWang(站内联系TA)哈哈哈哈，回帖就有金币拿:Ddaidai0124(站内联系TA)本人现在只是小规模的提取酶,马上要上发酵罐,需要大规模的提取酶液,不是做酶学性质,所以酶的纯度要求不高,和工业用酶的纯度差不多就可以了!希望大家推荐个适合工业化提取酶液的工艺,主要考虑成本问题.请版主帮忙在增加悬赏金币20个lvgl158(站内联系TA)起码知道 它的分子量 才能知道是否可以用同一个膜 如果小于一万可能就有点难度 可以先用少量的硫酸铵澄清 离心后 进行超滤 在超滤前 必须的保证液体 清澈hezhao999(站内联系TA)体积的在200ml以上用超滤仪，200ml以下可以用超滤离心管，如果不知分子量选用1000的膜完全可以了，如果知道分子量，则选择酶分子量1/5的超滤膜。zhaocy8903(站内联系TA)多大规模的发酵 多大规模的发酵

D. 如何利用透析法进行脱盐浓缩蛋白

二、蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：
（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法
1、蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。
蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。
其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。
蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
2、等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。
3、低温有机溶剂沉淀法
用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。
（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法
1、透析与超滤
透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。
超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。
2、凝胶过滤法
也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex
ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。
（三）根据蛋白质带电性质进行分离
蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。
1、电泳法
各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。
2、离子交换层析法
离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE?FONT
FACE="宋体"
LANG="ZH-CN">纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。（详见层析技术章）
（四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法
亲和层析法（aflinity
chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）
和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。
细胞的破碎
1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。
4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。

无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
浓缩、干燥及保存
一、样品的浓缩
生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的：
1、减压加温蒸发浓缩
通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。
2、空气流动蒸发浓缩
空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。
3、冰冻法
生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。
4、吸收法
通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。
5、超滤法
超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo
超滤膜的分子量截留值：
膜名称分子量截留值孔的大的平均直径
XM－300300，000140
XM－200100，00055
XM－5050，00030
PM－30 30，00022
UM－2020，00018
PM－1010，00015
UM－21，00012
UM05500 10

用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。

E. 蛋白在超滤管浓缩过程中出现沉淀怎么办

1、选择合适的超滤管，主要考虑MWCO和浓缩体积，最常见的是Ultra-15（10kD）。
通常应截留分子量不应专大于目的蛋属白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量为35kDa，就可以选择10kDa截留分子量的超滤管。
若目的蛋白分子量为10kD左右，则可以用截留分子量3kD的超滤管。认真阅读使用说明书，注意超滤膜对各种化学物质的耐受程度有所不同，表格中有。

2、新买来的超滤是干燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全过膜，冰浴或冰箱里预冷几分钟。然后将水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超过管顶的白线为准。操作要轻，加入蛋白液前，超滤管需要插在冰上预冷。

3、平衡。质量和重心二者都要达到平衡。注意转速和加速度不可太快，否则直接损坏超滤膜。

注意，一定要等离心机达到目的转速之后，方可离开
离心机，否则离心机出问题时，无法第一时间处理，后果不可预测！膜与转轴的方向根据说明书调整（角转离心机的情况是膜与轴垂直）。在实际使用中，一般转速开的比说明书里的要低，这样可以延长离心管的使用寿命。

F. 蛋白纯化过程中，超滤能除咪唑吗

您好！可以的，但是超滤除的不是很干净，用分子筛干净些。

网络教育团队【海纳百川团】为您解答。
感谢您的采纳 O(∩_∩)O 。如有疑问，欢迎追问。

G. 工业生产蛋白,提取液脱盐用什么方法超滤还是离子交换树脂好些理由是什么比如成本和效率方面

超滤，用于截留水中胶体大小的颗粒，而水和低分子量溶质则允许透过膜。由膜表面机械筛分、膜孔阻滞和膜表面及膜孔吸附的综合效应，以筛滤为主。所以超滤不能做为脱盐设备，一般用在反渗透前做除盐水预处理设备。
如果在你的问题中选的话只能用离子交换树脂了。

离子交换法是以圆球形树脂(离子交换树脂)过滤原水，水中的离子会与固定在树脂上的离子交换。常见的两种离子交换方法分别是硬水软化和去离子法。硬水软化主要是用在反渗透(RO)处理之前，先将水质硬度降低的一种前处理程序。软化机里面的球状树脂，以两个钠离子交换一个钙离子或镁离子的方式来软化水质。 离子交换树脂利用氢离子交换阳离子，而以氢氧根离子交换阴离子；以包含磺酸根的苯乙烯和二乙烯苯制成的阳离子交换树脂会以氢离子交换碰到的各种阳离子(例如Na+、Ca2+、Al3+)。同样的，以包含季铵盐的苯乙烯制成的阴离子交换树脂会以氢氧根离子交换碰到的各种阴离子(如Cl-)。从阳离子交换树脂释出的氢离子与从阴离子交换树脂释出的氢氧根离子相结合后生成纯水。 阴阳离子交换树脂可被分别包装在不同的离子交换床中，分成所谓的阴离子交换床和阳离子交换床。也可以将阳离子交换树脂与阴离子交换树脂混在一起，置于同一个离子交换床中。不论是那一种形式，当树脂与水中带电荷的杂质交换完树脂上的氢离子及(或)氢氧根离子，就必须进行“再生”。再生的程序恰与纯化的程序相反，利用氢离子及氢氧根离子进行再生，交换附着在离子交换树脂上的杂质。

H. 同一个超滤浓缩管可以用来纯化不同的蛋白吗

不可以的
不管是哪个公司生产超滤浓缩管使用后都会有蛋白残留在滤膜上，而不管是使用氯版化钠或者氢氧权化钠清洗都不能确保可以完全清理掉残留在膜上的蛋白。
如果不同的蛋白间混合使用，可能前一个蛋白会污染到后一个蛋白，甚至有些某些高活性的酶残留在上面会造成后一个蛋白被酶切降解，造成不必要的损失。

I. 纯化的单克隆抗体，超滤浓缩的时候会把磷酸盐离心掉导致抗体的缓冲环境变成水吗

不会来的。。。
超滤浓缩对于自缓冲液成分不会有任何改变的，因为PBS中的磷酸根离子也好，氯离子也好，钠离子也好都是很小的离子，可以在溶液中自由扩散，不会因为超滤离心就被甩到下层滤液中去。
你可以做个简单的实验，取一定体积PBS溶液测一下pH值和电导率值，之后用超滤管去离心。取出上层未被滤完的溶液再测一下pH值和电导率值，会发现pH值和电导率值和之前测的是一样的。即可证明未被滤完的溶液还是PBS溶液，而不是水。

J. 我的样品层析下来后约超过1L，是否有合适的超滤系统可进行最后一步的浓缩换液

有试过赛多利斯有全自动超滤系统Sartoflow Smart吗？最小循环体积20ml，完全能够对1L的样品进行快速超滤换液。