偶联DNA超滤管

① 基因表达调控的主要要素

绪
论
一、问答
1．什么是生物化学？它主要研究哪些内容？
2．生物化学经历了哪几个发展阶段？各个时期研究的主要内容是什么？试举各
时期一二例重大成就。
第一章
蛋白质结构与功能
一、问答题
1．蛋白质在生命活动中有何重要意义？
2．蛋白质是由哪些元素组成的？其基本结构单元是什么？写出其结构通式。
3．蛋白质中有哪些常见的氨基酸？写出其中文名称和三字缩写符号，它们的侧链基团各有何特点？写出这些氨基酸的结构式。
4．组成蛋白质的氨基酸分几类？分类的依据是什么？
5．简述其结构特点和生物学作用？
6．蛋白质的空间结构分几个层次？各有何结构特点。
8．简述蛋白质的
a
-螺旋的结构特点。
9．何为蛋白质变性？变性在医学中的应用
10．简述蛋白质变性与变构的异同。
11．试述蛋白质结构与功能的关系。
12．如何利用蛋白的理化性质对蛋白质进行分离纯化？
二、解释下列名称
1.肽单元
2.变构效应
3.无规则卷曲
4.
a
-螺旋
5.
β
-折叠
6.
β
-转角
7.盐析
8.分段盐析
9.透析
10.超滤
11.氨基酸的等电点(
pI
)
12.模序
13.结构域
14.肽键
15．亚基
第二章
核酸结构与功能
一、问答题
1.
核酸彻底水解后可得到哪些成分？DNA与RNA的水解产物有何不同？
2.
比较
DNA和RNA的异同。
3.
DNA双螺旋结构要点。
4.
RNA
的分类及功能。
5.
比较原核生物和真核生物
mRNA一级结构的区别。
二、解释下列名词
1.增色效应与减色效应
2.DNA的变性与复性
3.核小体
4.DNA变性
5.熔解温度
6.核酸杂交
第三章
酶
一、问答题
1.
什么是酶？其化学本质是什么？
2.
酶作为生物催化剂具有什么特点？
3.
何为酶促反应动力学？影响酶促反应的因素有哪些？
4.
举例说明酶的特异性
5.
试说明酶变构调节的机制及生物学意义？
6.
何为同工酶及同工酶的生物学意义？
7.
试比较三种可逆性抑制的特点
8.
测定酶活力时应注意哪些问题？
二、解释下列名词
1.多酶复合体和多功能酶
2.全酶和辅助因子
3.辅基和辅酶
4.酶的活性中心
5.酶原
6.同工酶7.变构酶
8.酶活力
9.酶活力单位
10.比活力
11.米氏常数
第四章
糖代谢
一、问答题
1．试比较糖酵解与有氧氧化不同点。
2．试述丙氨酸异生为葡萄糖的主要反应过程及其酶。
3．试述乳酸异生为葡萄糖的主要反应过程及其酶。
4．简述6-磷酸葡萄糖的代谢去路。
5．简述B族维生素在糖代谢中的作用。
6．为什么肌糖原不能直接补充血糖？

② 如何防止DNA电泳拖尾

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。

其原因往往由于酶量过多或酶的质量差或酶的专一性不够，DNA模板量过大，dNTP浓度过高，Mg2 浓度过高，退火温度过低，循环次数过多，模板长于3kd所引起。

1. 减少酶量（一般以2单位Taq DNA聚合酶为基点，分梯度上下调一调，其他酶也差不多如此浓度，可以参考说明书）；加强DNA聚合酶的专一性或调换另一来源的专一性更好的DNA聚合酶。

2. 增加DNA聚合酶的专一性。

   （1）改用专一性更强的DNA聚合酶，或者使用两种不同的DNA聚合酶，减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。 （2）酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油，若此操作引起酶的浓度过高，可以适当加双蒸馏水稀释。

   （3）为了加强Taq DNA聚合酶的专一性。 的专一性，可在反应体系中加入：1-1.5mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率，两者可以增加Taq DNA聚合酶的稳定性。

3. 适当减少dNTP的浓度；减少dNTP的浓度一般需要与降低Mg2 浓度同方向偶联进行，但是不必按同样的比例。

4. 适当降低Mg2 浓 度，可以采用梯度递减方式，以每次0.5mol/L递减，但是Mg2 的终浓度不要低于1.0mol/L。

5. 缩短PCR反应的退火温度时间或调高复性温度。没有重新设计引物之前，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增，则在引物的Tm少5-10度的范围内把PCR反应的复性温度提高1-3度。

6. 使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。

7. 采用使用专一性更强的梯度降低PCR、热启动PCR和巢式PCR。使用热启动模式。使用热启动时可以购买商用的PCR热启动酶，也可以用石蜡隔离模式。巢式PCR也有现成的试剂盒可以购买。

8. 保证PCR反应的DNA模板的质量，要用电泳检测一下分子量和纯度，质量不好则要重新提取和纯化DNA模板；适当增加DNA模板量，减少循环次数。

9. 以上措施都不行时，最后就只能重新设计引物，加强引物的专一性。

10. 适当减少DNA模板量。

11. 适当减少循环次数，一般也就循环25次就差不多了。

③ 耐热菌的基因克隆

一、酶的概念
生物体内的新陈代谢过程包含着许多复杂而有规律的物质代谢和能量变化。绿色植物和某些细菌利用太阳光能、水、CO2和无机盐等简单物质，经过一系列变化，合成复杂的糖、脂、蛋白质等大分子物质，而动物又利用植物中的这些物质，并经过错综复杂的分解和合成、反应转化为自身所需要的一部分，使自己得以生长、繁殖等等。在实验室中，复杂有机物的合成与分解必须要在高温、高压、强酸强碱等剧烈条件下才能进行，如淀粉和蛋白质的水解；而有些反应则在体外难以进行，如蛋白质的合成。但是在生物体内虽然条件十分温和（370C左右、近中性pH值），这些反应却能顺利和快速的进行。例如，动物吃下的肉食在消化道内只需要几个小时便被完全消化分解；细菌在合适的条件下，二十分钟就增殖一代，在这短短的二十分钟内，合成了新细胞内所需要的全部的各种复杂的物质等等，这是什麽原因呢？这种使体内化学反应变得容易和迅速进行的根本原因就是生物体内普遍存在一种起催化作用的蛋白质--酶。
酶(enzyme)是活细胞内产生的具有高度专一性和催化效率的蛋白质，又称为生物催化剂。酶是生物体自身产生的，在新陈代谢过程中，几乎所有的化学反应都是在酶的催化下进行的，且条件温和，反应效率极高，使生物体内各种物质处于不断的新陈代谢中，从这个意义上讲，没有酶就没有生命。细胞内合成的酶主要是在细胞内起催化作用，也有些酶合成后释入血液或消化道，并在那里发挥其催化作用，人工提取的酶在合适的条件下也可在试管中对其特殊底物起催化作用。
二、酶的研究历史：酶学知识最初来源于生产生活实践（如发酵和酿造）和对疾病的治疗等。从有记载的史料中看，我国4千多年前的夏禹时代就盛行酿酒；周朝已开始制醋、酱、豆豉（在霉菌蛋白酶作用下产生的风味食品）饴糖（主要含麦芽糖），并用麴来治疗消化不良，直到现在仍是常见的健胃药。酶的系统研究起始于19世纪中叶对发酵本质的研究。Pasteur提出，发酵离不了酵母细胞。
国外知道酶的存在是和发酵联系在一起的。1833年，Payen从麦芽的抽提物中沉淀出一种对热不稳定的物质，它可促进淀粉水解成可溶性糖，人们开始意识到生物细胞中可能存在着一种类似催化剂的物质。1896年，W·Kuhne首先把这类物质称为"enzyme"，中文译为"酶"。1897年Buchner成功地用不含细胞的酵母液实现发酵，说明具有发酵作用的物质存在于细胞内，并不依赖活细胞。1926年Sumner首次提取出脲酶，并进行结晶，提出酶的本质是蛋白质，并几乎要参与所有的生命活动过程。
1982年以后陆续发现某些RNA和DNA也具有酶的催化功能，使人们进一步认识到，酶不都是蛋白质。现代科学认为，酶是由活细胞产生的，能在体内或体外起同样催化作用的一类具有活性中心和特殊构象的生物大分子，包括蛋白质和核酸。酶是一切生命活动的序幕，是机体内一切化学变化的激动者。本章只讨论蛋白质属性的酶。
现已有二千余种酶被鉴定出来，其中有二百余种得到结晶，特别是近几十年来，随着蛋白质分离技术的进步，酶的分子结构、酶作用机理的研究得到发展，有些酶的结构和作用机理已被阐明。总之，随着酶学理论不断深入，必将对揭示生命本质研究作出更大的贡献。