离子交换纯化抗体
⑴ 离子交换层析和亲和层析相比较哪个对蛋白(抗体)收率高
亲和
⑵ 求助离子交换柱纯化蛋白的问题
离子交换树脂是一类具有离子交换功能的高分子材料。在溶液中它能将本身的离子与溶液中的同号离子进行交换。按交换基团性质的不同，离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂两类。
阳离子交换树脂大都含有磺酸基（—SO3H）、羧基（—COOH）或苯酚基（—C6H4OH）等酸性基团，其中的氢离子能与溶液中的金属离子或其他阳离子进行交换。例如苯乙烯和二乙烯苯的高聚物经磺化处理得到强酸性阳离子交换树脂，其结构式可简单表示为R—SO3H，式中R代表树脂母体，其交换原理为
2R—SO3H＋Ca2＋ （R—SO3）2Ca＋2H+
这也是硬水软化的原理。
阴离子交换树脂含有季胺基[-N（CH3）3OH]、胺基（—NH2）或亚胺基（—NH2）等碱性基团。它们在水中能生成OH-离子，可与各种阴离子起交换作用，其交换原理为
R—N（CH3）3OH＋Cl- R—N（CH3）3Cl＋OH-
由于离子交换作用是可逆的，因此用过的离子交换树脂一般用适当浓度的无机酸或碱进行洗涤，可恢复到原状态而重复使用，这一过程称为再生。阳离子交换树脂可用稀盐酸、稀硫酸等溶液淋洗；阴离子交换树脂可用氢氧化钠等溶液处理，进行再生。
离子交换树脂的用途很广，主要用于分离和提纯。例如用于硬水软化和制取去离子水、回收工业废水中的金属、分离稀有金属和贵金属、分离和提纯抗生素等。
⑶ 多克隆抗体的纯化方法都有哪些急需高手讲解
纯化抗体的方法较多来，建议用蛋白自A 或蛋白G 微球纯化法作为最常用的方法。这种方法效率高，能为常用的实验方法提供足够纯化的抗体，而且随着商品化的蛋白A，和蛋白G 基质的出现，能将任何来源的抗体纯化。抗体的纯化也可采用传统的色谱法，在某些情况下非常有用。这些方法包括DEAE 离子交换色谱法、硫酸镀沉淀法及其他方法。但是用蛋白G 或蛋白A 亲和柱法纯化较其他方法简单，并且纯化效果是其他方法的数倍。因此在所有方法中，我推荐这种方法。
有一种情况不适于应用蛋白G 或蛋白A 亲和柱纯化抗体，即多克隆抗体需要进一步分离，且针对某种特异性抗原的组分需要分离。此时可用抗原结合的亲和柱纯化抗原恃异性抗体。
原理就是抗原抗体的结合。蛋白A和G被锚定在树脂上，IgA和IgG在过树脂柱子的时候能够被protein A和protein G捕获，留在柱子上，其他的杂蛋白会被洗掉，最后用特殊的洗脱液能够将IgA和IgG纯化下来。原理跟普通蛋白纯化的原理是一样的，只不过吸附介质不一样而已。
~.~
⑷ 多克隆抗体的纯化方法都有哪些
纯化抗体的方法较多,建议用蛋白A 或蛋白G 微球纯化法作为最常用的方法专.这种方法效率高属,能为常用的实验方法提供足够纯化的抗体,而且随着商品化的蛋白A,和蛋白G 基质的出现,能将任何来源的抗体纯化.抗体的纯化也可采用传统的色谱法,在某些情况下非常有用.这些方法包括DEAE 离子交换色谱法、硫酸镀沉淀法及其他方法.但是用蛋白G 或蛋白A 亲和柱法纯化较其他方法简单,并且纯化效果是其他方法的数倍.因此在所有方法中,我推荐这种方法.
有一种情况不适于应用蛋白G 或蛋白A 亲和柱纯化抗体,即多克隆抗体需要进一步分离,且针对某种特异性抗原的组分需要分离.此时可用抗原结合的亲和柱纯化抗原恃异性抗体.
原理就是抗原抗体的结合.蛋白A和G被锚定在树脂上,IgA和IgG在过树脂柱子的时候能够被protein A和protein G捕获,留在柱子上,其他的杂蛋白会被洗掉,最后用特殊的洗脱液能够将IgA和IgG纯化下来.原理跟普通蛋白纯化的原理是一样的,只不过吸附介质不一样而已.
⑸ 单克隆抗体的纯化技术操作步骤
从培养液或腹腔积液获得的单克隆抗体，不需要纯化即可应用于日常诊断或定性研究。如果用于免疫标记测定，须分离和纯化。可用半饱和、饱和硫酸铵进行沉淀，进行初步浓缩和纯化；可用亲和层析法进一步纯化。
一、腹水型单抗的纯化
在单抗纯化之前，一般均需对腹水进行预处理，目的是为了进一步除去细胞及其残渣、小颗粒物质、以及脂肪滴等。常用的方法有二氧化硅吸附法和过滤离心法，以前者处理效果为佳，而且操作简便。
1、二氧化硅吸附法
新鲜采集的腹水（或冻存的腹水），2000r/min 15分钟，除去细胞成分（或冻存过程中形成的固体物质）等；取上层清亮的腹水，等量加入PH7.2巴比妥缓冲盐水（VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg2+，0.3mmol/L Ca2+）稀释；然后以每10ml稀释腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，悬液在室温孵育30分钟，不时摇动；2000g离心20分钟，脂质等通过该法除去，即可得澄清的腹水。
2、过滤离心法
用微孔滤膜过滤腹水，以除去较大的凝块及脂肪滴；用10000g 15分钟高速离心（4℃）除去细胞残渣及小颗粒物质。
3、混合法
即上述两法的组合，先将腹水高速离心，取上清液再用二氧化硅吸附处理。
二、单抗的粗提
1、硫酸铵沉淀法
（1）饱和硫酸铵溶液的配制
500g硫酸铵加入500ml蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出的结晶任其留在瓶中。临用前取所需的量，用2mol/L NaOH调PH至7.8。
（2）盐析
吸取10ml处理好的腹水移入小烧杯中，在搅拌下，滴加饱和硫酸铵溶液5.0ml；继续缓慢搅拌30分钟；10000r/min离心15分钟；弃去上清液，沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮，搅拌作用30分钟，同法离心；重复前一步1-2次；沉淀物溶于1.5ml PBS（0.01mol/L PH7.2）或Tris-HCl缓冲液中。
（3）脱盐
常用柱层析或透析法。柱层析法是将盐析样品过Sephadex G-50层析柱，以PBS或Tris-HCl缓冲液作为平衡液和洗脱液，流速每分钟1ml。第一个蛋白峰即为脱盐的抗体溶液。透析法是将透析袋于2% NaHCO3，1mmol/L EDTA溶液中煮10分钟，用蒸馏水清洗透析袋内外表面，再用蒸馏水煮透析袋10分钟，冷至室温即可使用（并可于0.2mol/L EDTA溶液中，4℃保存备用）。将盐析样品装入透析袋中，对50-100倍体积的PBS或Tris-HCl缓冲液透析（4℃）12-24小时，其间更换5次透析液，用萘氏试剂（碘化汞11.5g，碘化钾8g，加蒸馏水50ml，待溶解后，再加20% NaOH 50ml）检测，直至透析外液无黄色物形成为止。
（4）蛋白质含量的测定
（Pr）（mg/ml）=（1.45×OD280-0.74×OD260）×稀释倍数；或（Pr）=OD280×稀释倍数/1.3
（5）分装冻存备用
2、辛酸-硫酸铵沉淀法
该法简单易行，适合于提纯IgG1和IgG2b，但对IgG3和IgA的回收率及纯化效果差。其主要步骤如下：取1份预处理过的腹水加2份0.06mol/L PH5.0醋酸缓冲液，用1mol/L HCl调PH至4.8；按每毫升稀释腹水加11ul辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4℃静置2小时，取出15000g离心30分钟，弃沉淀；上清经尼龙筛过滤（125um），加入1/10体积的0.01mol/L PBS，用1mol/L NaOH调PH至7.2；在4℃下加入饱和硫酸铵至45%饱和度，作用30分钟，静置1小时；10000g离心30分钟，弃上清；沉淀溶于适量PBS（含137mmol/L NaCl，2.6mol/L KCl，0.2mmol/L EDTA）中，对50-100倍体积的PBS透析，4℃过夜，其间换水3次以上；取出10000g离心30分钟，除去不溶性沉渣，测定蛋白质含量后，分装，冻存备用。
3、优球蛋白沉淀法
该法适用于IgG3和IgM型单抗的提取，所获制品的抗体活性几乎保持不变，对IgG3单抗的回收率高于90%，对IgM单抗的回收率为40-90%不等。其操作步骤如下：取一定量的预处理过的腹水，先后加入NaCl和CaCl2，使各自的浓度分别达0.2mol/L和25mmol/L，随之可见纤维蛋白的产生；经滤纸过滤后，滤液对100倍体积的去离子水透析，4℃ 8-15小时（若是IgG3单抗，也可室温2小时），其间换水1-2次；取出后22000g离心30分钟，弃上清；将沉淀溶于PH8.0 1mol/L NaCl，0.1mol/L Tris-HCl溶液中，重复上述的透析与离心；将沉淀的优球蛋白浓度调至5-10mg/ml，分装冻存备用。
三、单抗纯化的方法
单抗纯化的方法有很多种，应根据具体单抗的特性和实验条件选择适宜的方法，常用的技术有DEAE离子交换层析柱、凝胶过滤法和亲和层析法三种。
1、离子交换层析：
分离蛋白质是根据在一定pH 条件下，蛋白质所带电荷不同而进行的分离方法。常用于蛋白质分离的离子交换剂有弱酸型的羧甲基纤维素(CM纤维素) 和弱碱型的二乙基氨基乙基纤维素(DEAE纤维素)。前者为阳离子交换剂，后者为阴离子交换剂。
离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来
2、凝胶过滤法：
一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外。洗脱时，大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小，小分子则在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大。
缺点：从凝胶过滤的原理可知，蛋白质分子通过凝胶柱的速度(即洗脱体积的大小)并不直接取决于分子的质量，而是它的斯笃克半径，利用凝胶过滤法测定蛋白质分子量时，标准蛋白质(已知分子量和斯笃克半径)和待测蛋白质必须具有相同的分子形状(接近球体)，否则不能得到比较准确的分子量。分子形状为线形的或与凝胶能发生吸附作用的蛋白质，则不能用此方法测定分子量。而且柱子成本比较高，整个实验过程耗时很长。
3、免疫亲和层析法：
是利用生物体内存在的抗原、抗体之间高度特异性的亲和力进行分离的方法。亲和层析的应用主要是生物大分子的分离、纯化。利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。例如将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体。在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓度通常较低。
用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进行分离，而亲和层析法则是一种非常有效的方法。将所需蛋白质作为抗原，经动物免疫后制备抗体，将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂，就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。
⑹ 抗体蛋白质纯化的好方法
抗体纯化分了几种类型，根据用途决定选择哪种方法进行纯化：
1. 粗纯：将制备抗回体的血清或答是腹水，细胞上清，直接用盐析法进行处理，这样可以将这些物质里面的其他杂质去掉，获得蛋白的成分，但是由于是粗纯，里面会混有大量的其他蛋白，这样获得的抗体，纯度较低，用于实验中背景比较高。
2.通用型纯化：用抗体结合蛋白Protein A，Protein G或者Protein L。因为不同来源的抗体和这些抗体结合蛋白的结合能力不同，所以需要根据抗体来源选择使用哪种抗体将诶和蛋白最好。对于有一些单链抗体，则多半使用protein L来进行纯化。经过抗体结合蛋白的亲和纯化后，溶液中基本只保留了抗体的成分，其他蛋白都去掉了，抗体纯度可以比较高。相对来说，这种方法是大规模抗体制备中，用得最多的纯化方法，很多抗体公司都采用这种方法来对抗体进行纯化。
3.特异型纯化：但是有些抗体，需要纯度特别高，特异性特别好，就不能简单采用上述两种方法进行纯化了。必须要通过将抗原固定制备成特异的亲和纯化柱，再纯化抗体。这个时候得到的就全是针对一种抗原的抗体了，特异性最好。当然，由于牵涉到抗原固定等操作，成本相应是最高的。
⑺ 如何将多克隆抗体进行分离纯化
多克隆抗体的提取纯化
一、批量提取法
称取DEAE-纤维素(DE32或DE52)50g，置于1000ml烧杯中，先以蒸馏水漂浮除去细颗粒，再经酸碱处理后，用0.01～0.05mol/L，pH8.0左右的磷酸盐缓冲液(PB)平衡。将水分抽干，或用布氏滤斗(内放两层滤纸)过滤，收集湿纤维素，以降低其离子强度。按1ml血清加湿重5g DEAE纤维素，经过充分搅拌，置4℃吸附1h。上清液可再如此处理一次，即获得较纯的IgG。该法提取IgG简便，既可小量提取，也可大量制备。
二、Tris-Cl离子交换层析法(Ion-exchange chromatography)
材料和试剂
1. DE32或DE52纤维素。
2. HCl；NaOH；0.01～0.05mol/L，pH8.0 PB；0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl；0.5mol/L NaCl。
3. 待纯化标本：杂交瘤腹水或培养上清，免疫血清或饱和硫酸铵粗提品。
4. 1.5×50cm 层析柱；透析袋；紫外分光光度计及其他透析和层析所需的试剂和器材。
操作步骤
1.DE52纤维素的处理：DE52经酸、碱处理，0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl平衡。
2. 装柱：将层析柱固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出口接一细塑料管并关闭出水。将浸泡于0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl中的DE52沿玻璃棒倒入柱中，待DE52自然沉降3～5cm高时，吸除0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl，或松开出水口螺旋夹，控制流速1～2ml/min，同时连续加入DE52至所需高度。待DE52完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片。
3. 平衡：松开出水口螺旋夹，以0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl平衡，控制流速为15滴/min，待流出液与洗脱液之pH值达到一致时，停止平衡。
4. 待提取样品的准备：将蛋白装入透析袋里，置4℃冰箱，对0.01mol/L pH8.6 Tris-Cl透析过夜。
5. 加样、洗脱与收集：用吸管吸去柱面液体，以毛细吸管沿柱壁加入样品，样品体积相当于柱床体积的1％～2％，蛋白浓度为50～70mg。启开出水口螺旋夹使样品缓慢进入柱床内，并用少量洗脱液清洗柱壁；待液体进入柱床后，以0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl洗脱，控制流速为14～16滴/min。分部收集器收集，紫外监测，或人工收集，以紫外分光光度计分别测定每管280nm OD值，描绘洗脱液峰。
6. 浓缩：将洗脱液的280nm OD上峰段与下峰段各管分别合并，装入透析袋，以PEG浓缩至所需体积。
三、Tris-PO4 离子交换层析法
该法在上述方法的基础上稍加改良，即通过梯度洗脱，可用于血清中IgG和IgM的提取。
材料和试剂
1. DE32或DE52纤维素。
2. 待纯化标本：杂交瘤腹水或培养上清，免疫血清或饱和硫酸铵粗提品。
3. 1.5×50cm 层析柱；透析袋及其他透析和层析所需的试剂和器材。
4. 梯度洗脱液包括：0.005 mol/L，pH8.6 Tris-PO4 ；0.055mol/L，pH6.0 Tris-PO4 ；0.5mol/L，pH5.1 Tris-PO4 。
操作步骤
1. 蛋白标本对0.005mol/L，pH8.6 Tris-PO4 透析。
2. DE52装柱，并以0.005mol/L，pH8.6 Tris-PO4 平衡。
3. 加样，以0.005mol/L，pH8.6 Tris-PO4 洗脱，紫外监测直至洗脱液280nm OD回到基线。这一步骤可除去血清中其他蛋白。
4. 以350ml 0.055mol/L，pH6.0 Tris-PO4 洗脱，这一步骤可用于纯化血清IgG和IgM。
5. 以125ml 0.055mol/L，pH6.0 Tris-PO4 和125ml 0.5mol/L，pH5.1 Tris-PO4 梯度洗脱，总量收集250ml；重复步骤（5）。
6. 根据280nm峰值合并蛋白峰，透析浓缩和保存同上。
用过的DE52可用0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl和0.5mol/L NaCl、0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl梯度洗脱回收。再用蒸馏水洗至中性，加入0.02％叠氮钠于4℃保存备用。
⑻ 离子交换层析法分离纯化蛋白质有哪些局限性
因为离子交换吸附蛋白质并不是特异性吸附，在某些情况下可能难以判断结合的蛋版白质权是否为当初设计的目的蛋白。
离子交换吸附依赖于蛋白质表面的静电荷，如果蛋白质结构比较特殊，可能会有在各种pH都难以结合上离子交换层析的情况。
离子交换层析对于等电点与目标蛋白接近的杂蛋白并没有很好的分离效果。
⑼ 如何将抗体的Fab片段进行酶切及纯化
[求助]如何将抗体的Fab片段进行酶切及纯化
各位老师：
我现在准备将一株鼠源性单克专隆抗属体进行酶切制备Fab片段并将其进行纯化。我是一个新手，前几天作过两次试验，一次用木瓜蛋白酶进行酶切，一次用无花果蛋白酶进行酶切，结果都不好，现在很着急，请那位有经验的老师帮助我一下，将您的经验和试验过程教一教我，不胜感激。
可以看看免疫方面的书，《简明免疫学技术》科学出版社140页，切后纯化可以用疏水，离子交换。