层析过滤器

❶ 为什么凝胶过滤层析柱会漏水

凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)
凝胶过滤层析法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。
也叫做分子排阻层析（molecular-exclusion chromatography）。一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。 一般是大分子先流出来，小分子后流出来。
凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下来速度慢，而大分子物质却被排除在外部，下来的速度快，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。
⒈凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用SephadexG-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。
⒉柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。
⒊凝胶柱的制备凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。
凝胶的装填：将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加到层析的流速，千万不能超过最终流速。平衡凝胶床过夜，使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，或加一些有色物质来观察色带的移动，如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好，色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。
⒋加样和洗脱凝胶床经过平衡后，在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和，再用滴管加入样品。一般样品体积不大于凝胶总床体积的5％-10％。样品浓度与分配系数无关，故样品浓度可以提高，但分子量较大的物质，溶液的粘度将随浓度增加而增大，使分子运动受限，故样品与洗脱液的相对粘度不得超过1.5-2.样品加入后打开流出口，使样品渗入凝胶床内，当样品液面恰与凝胶床表面相平时，再加入数毫升洗脱液中洗管壁，使其全部进入凝胶床后，将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连，预先设计好流速，然后分部收集洗脱液，并对每一馏份做定性、定量测定。
⒌凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入0.02％的叠氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。
如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用70％、90％、95％乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90％以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。
⒍凝胶层析的应用
⑴脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25％-30％，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。
⑵用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。
⑶测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的的分子量。
⑷高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液

❷ SDS-PAGE和分子筛过滤层析测定蛋白质分子量在原理和方法上有何不同。

sds分离靠的是在电场中蛋白质分子跟page的结合后的分子量大小从而在凝胶中跑的速度回不同而分开的。

分子筛是根据答不同分子量的分子大小不同,从而进行蛋白质分离,达到测量分子量的目的的。

SDS-PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳，作用：用于分离蛋白质和寡核苷酸。

作用原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）和SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。

而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（SDS即十二烷基硫酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。

❸ 凝胶过滤层析的基本原理是什么

凝胶过滤层析又称为排阻层析或分子筛方法。其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的目的。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。

❹ 凝胶过滤层析可根据蛋白质的大小将之分离...

小分子量蛋白质
大分子量蛋白质

❺ 凝胶过滤层析的优点

它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。

❻ 影响凝胶过滤层析分辨率的主要因素有哪些

(1)层析柱的选择
层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。一般柱长度不超过100cm，为得到高分辨率，可以将柱子串联使用。层析柱的直径和长度比一般在1:25－1:100之间。用于分组分离的凝胶柱，如脱盐柱由于对分辨率要求较低，所以一般比较短。
(2)凝胶柱的鉴定
凝胶柱的填装情况将直接影响分离效果，关于填装的方法前面已有介绍，这里主要介绍对填装好的凝胶柱的鉴定。凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。另外通常可以采用一种有色的物质，如蓝色葡聚糖-2000、血红蛋白等上柱，观察有色区带在柱中的洗脱行为以检测凝胶柱的均匀程度。如果色带狭窄、平整、均匀下降，则表明柱中的凝胶填装情况较好，可以使用；如果色带弥散、歪曲，则需重新装柱。另外值得一提的是，有时为了防止新凝胶柱对样品的吸附，可以用一些物质预先过柱，以消除吸附。
(3)洗脱液的选择
由于凝胶层析的分离原理是分子筛作用，它不象其它层析分离方式主要依赖于溶剂强度和选择性的改变来进行分离，在凝胶层析中流动相只是起运载工具的作用，一般不依赖于流动相性质和组成的改变来提高分辨率，改变洗脱液的主要目的是为了消除组分与固定相的吸附等相互作用，所以和其它层析方法相比，凝胶层析洗脱液的选择不那么严格。由于凝胶层析的分离机理简单以及凝胶稳定工作的pH 范围较广，所以洗脱液的选择主要取决于待分离样品，一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析。为了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓度的盐。
(4)加样量
关于加样前面已经有所介绍，要尽量快速、均匀。另外加样量对实验结果也可能造成较大的影响，加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。加样量的多少要根据具体的实验要求而定：凝胶柱较大，当然加样量就可以较大；样品中各组分分子量差异较大，加样量也可以较大；一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1％－5％左右，而分组分离时加样体积可以较大，一般约为凝胶柱床体积的10％－25％。如果有条件可以首先以较小的加样量先进行一次分析，根据洗脱峰的情况来选择合适的加样量。设要分离的两个组分的洗脱体积分别为Ve1和Ve2，那么加样量不能超过(Ve1－Ve2)。实际由于样品扩散，所以加样量应小于这个值。
从洗脱峰上看，如果所要的各个组分的洗脱峰分得很开，为了提高效率，可以适当增加加样量；如果各个组分的洗脱峰只是刚好分开或没有完全分开，则不能再加大加样量，甚至要减小加样量。另外加样前要注意，样品中的不溶物必须在上样前去掉，以免污染凝胶柱。样品的粘度不能过大，否则会影响分离效果。
(5)洗脱速度
洗脱速度也会影响凝胶层析的分离效果，一般洗脱速度要恒定而且合适。保持洗脱速度恒定通常有两种方法，一种是使用恒流泵，另一种是恒压重力洗脱。洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、颗粒大小等，一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好。但洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽，反而会降低分辨率，而且实验时间会大大延长；所以实验中应根据实际情况来选择合适的洗脱速度，可以通过进行预备实验来选择洗脱速度。一般凝胶的流速是2－10 cm/hr，市售的凝胶一般会提供一个建议流速，可供参考。总之，凝胶层析的各种条件，包括凝胶类型、层析柱大小、洗脱液、上样量、洗脱速度等等，都要根据具体的实验要求来选择。例如样品中各个组分差异较小，则实验要求凝胶层析要有较高的分辨率，提高分辨率的选择应主要包括：选择包括各个待分离组分但分离范围尽量小一些的凝胶，选择颗粒小的凝胶，选择分辨率高的凝胶类型，选择较长、直径较大的层析柱、减少加样量、降低洗脱速度等等。

❼ 凝胶过滤层析的使用方法

⒈凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用SephadexG-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。
⒉柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。
⒊凝胶柱的制备凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。
凝胶的装填：将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加到层析的流速，千万不能超过最终流速。平衡凝胶床过夜，使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，或加一些有色物质来观察色带的移动，如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好，色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。
⒋加样和洗脱凝胶床经过平衡后，在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和，再用滴管加入样品。一般样品体积不大于凝胶总床体积的5%-10%。样品浓度与分配系数无关，故样品浓度可以提高，但分子量较大的物质，溶液的粘度将随浓度增加而增大，使分子运动受限，故样品与洗脱液的相对粘度不得超过1.5-2.样品加入后打开流出口，使样品渗入凝胶床内，当样品液面恰与凝胶床表面相平时，再加入数毫升洗脱液中洗管壁，使其全部进入凝胶床后，将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连，预先设计好流速，然后分部收集洗脱液，并对每一馏份做定性、定量测定。
⒌凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入0.02%的叠氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。

❽ SDS-PAGE和分子筛过滤层析测定蛋白质分子量在原理和方法上有何不同

电泳法分离蛋白质是根据蛋白质的什么原理：一般是通过生化方法吧蛋白提取出来，蛋白质带有电荷么，是将混合样品中的蛋白质，其原理是第一向基于蛋白质PI不同用等电聚焦，电泳时的正极与负极都会发生电解反应，向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。是根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物的方法。1、电泳：在外电场的作用下，带点颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。电泳技术可用于氨基酸、肽、蛋白质和核苷酸等生物分子的分析分离和制备。区带电泳是由于在支持物上电泳蛋白质混合物被分离为若干区带。电泳前用缓冲液浸润薄膜或滤纸等支持物或用缓冲液直接配置成凝胶，将待分离的蛋白质样品加在它的一端或中央，支持物的两端与电极连接，通电电泳。电泳完毕，各个组分分布在不同的区域，用显色剂（蛋白质可用考马斯亮蓝或氨基黑等染色）显色后可以显示出各个组分。氨基酸混合物特别是寡聚核苷酸混合物一次电泳往往不能完全分开。这种情况可以将第一次电泳分开的斑点通过支持介质间的接触印迹转移到第二个支持介质上，旋转90°，进行第二次电泳。这种方法称为双向电泳。2、聚丙烯酰胺凝胶电泳：以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，一般制成凝胶柱或凝胶板，凝胶是由相连的两部分组成（小的部分是浓缩胶，大的部分为分离胶），这两部分凝胶的浓度、缓冲液组分和离子强度、pH以及电场强度都是不同的，即不连续性。电泳时样品首先在不连续的两相间积聚浓缩而成很薄的起始区带，然后再进行电泳分离。电泳有三种物理效应：1、样品的浓度效应；2、凝胶对被分离分子的筛选效应；3、一般电泳分离的电荷效应。3、毛细管电泳：高效毛细管电泳、毛细管区带电泳、自由溶液毛细管电泳、毛细管电泳，可分离氨基酸、肽、蛋白质、DNA片段和核酸以及多种小分子，也可用于手性化合物的分离。毛细管减少了由于热效应产生的许多问题，可以提高热散失，有助于消除由于热引起的扩散增加而造成的对流和区带变宽，因此管中不需要加入稳定介质即可进行自由流动电泳。电泳迁移引起溶液中荷电分子向相反电荷的电极移动，虽然被分析样品因电泳迁移而分离，然而电渗作用使溶液向负极流动，而且电渗电流很强，其速度一般比样品的电泳速率答，因此所有的正、负离子和中性分子都被推向负极。对荷正电分子来说，电泳迁移和电渗流效果是一致的，而且移动最快，最先达到负极。随着被分离的分子接近负极，它们都将通过紫外检测器并把信号传递给记录仪。所得结果是被分离组分的紫外吸收对时间的峰谱。4、等点聚焦（IEF）分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质（如浓蔗糖溶液）中进行。在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦在等于其等电点的梯度处，并形成一个很窄的区带。pH梯度制作一般利用两性电解质，它是脂肪族多胺和多羧类的同系物，它们具有相近但不相同的解离常数和等电点。在外电场作用下，自然形成pH梯度。5、层析聚焦：根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。原理：当用特种缓冲液滴洗填充在柱中的特种多缓冲交换剂时，就会在层析柱中自上而下自动的建立起连续的pH梯度；同时加在柱上端的蛋白质样品也随多缓冲液的按各自的等电点聚焦在相应的pH区段。并在过程中随pH梯度下移，蛋白质混合物的各组分先后从柱中流出，达到分离纯化的目的。

❾ 凝胶过滤层析法加样是应注意哪些问题

一般来分为三个步骤：装柱源、加样、洗脱淋洗。
装柱是需要注意的是：【1】垂直放置 【2】放置产生气泡 【3】放置柱分层
加样时，【1】加样前打开出口，使展开剂流出，至正好露出凝胶上平面时，立即关闭出口
【2】加样时，用滴管缓缓沿柱内壁加入柱子
【3】打开柱子得出口，使待分离的样品进入柱子。
加样完成后，进行洗脱。