反渗透膜制孔添加PEG

㈠ 为什么PEG能模拟干旱环境

2018年初，安徽农业大学茶叶生物学与资源利用国家重点实验室主任、宛晓春教授课题组，针对茶树叶肉细胞质膜H+-ATPase在干旱和复水条件下调节钾稳态的研究成果，在The Crop Journal上发表题为Maintenance of mesophyll potassium and regulation of plasma membrane H+-ATPase areassociated with physiological responses of teaplants to drought and subsequent rehydration的研究成果。这是利用非损伤微测技术（Non-invasive Micro-test Technology, NMT），首次将离子流与膜电位数据相结合，测定茶树叶肉细胞H+、K+和膜电位，揭示茶树在干旱和复水处理下生理的机制变化。张显晨博士为本文第一作者。

活体叶肉细胞H+流、K+流检测。

茶树在干旱、复水条件下，叶肉细胞K+流变化。正值代表外排。

旱害严重影响茶树生长发育，造成茶叶减产和品质下降。揭示茶树抗旱机理，对培育耐旱茶树品种，应对干旱胁迫具有重要的理论意义。

课题组以茶树一叶为研究对象，通过PEG和复水模拟干旱和补水灌溉。干旱抑制茶树叶肉细胞质膜H+-ATPase活性，诱导H+内流，介导膜电位去极化，激活K+外排，削弱了叶肉细胞对K+的滞留；复水激活了茶树叶肉细胞质膜H+-ATPase活性，加剧H+外排，超极化膜电位，抑制了K+外排，促进了叶肉细胞对K+的滞留。因此推测叶片质膜H+-ATPase可能参与调控茶树叶片钾稳态对干旱和复水响应。

茶树在干旱、复水条件下，叶肉细胞膜电位变化

本文第一作者，来自茶叶生物学与资源利用国家重点实验室的张显晨博士，一直专注茶树逆境研究，已经利用非损伤微测技术，在茶树氟富集、干旱胁迫、酸胁迫、铝胁迫等方向，发表3篇SCI文章、1篇中文核心文章。

Efficient iron plaque formation on tea(Camellia sinensis) roots contributes to acidic stress tolerance. JIntegr Plant Biol. 2018, doi: 10.1111/jipb.12702.
Maintenance of mesophyll potassium andregulation of plasma membrane H+-ATPase are associated with physiologicalresponses of tea plants to drought and subsequent. Crop J. 2018,6(6):611-620.
Al3+-promoted fluorideaccumulation in tea plants (Camellia sinensis) was inhibited by an anionchannel inhibitor DIDS. J Sci Food Agric. 2016, 96(12):4224-30.
Ca2+ 信号在DIDS( 4，4－二异硫氰－2，2－二磺酸)抑制茶树吸收氟的功能研究. 南京农业大学学报.2016.

本文第一作者、安徽农业大学张显晨博士，接受中关村NMT联盟采访

致 谢

㈡ 化学里PEG的结构和性质，要全面的，可不断追加给高分

药用聚乙二醇

组成：乙二醇和环氧乙烷聚合物 别名：碳蜡、PEG

结构式：CH2（OH）-（CH2CH2O）n -CH2OH

目前加工系列产品有：
PEG-4000 120～400(目)
PEG-6000 120～500(目)
PEG-8000 120～600(目)
PEG-20000 120～800(目)

性状及用途：
聚乙二醇系列产品通常情况下溶于水和多种有机溶剂，不溶于脂肪烃、苯、乙二醇等，不会水解变质，有广泛的溶解范围和优良的相容性、很好的稳定性、润滑性、成膜性、增塑性、分散性等。系低毒物质，且无刺激性，属非离子型聚合物。

应 用：
聚乙二醇的应用有两种方式：一种是PEG包含在最终产品中，例如：医药用的油膏、软膏、洗液、栓剂、片剂和非肠道用溶液；在化妆品中的牙膏、发乳、除臭剂、洗净膏；造纸工业中用于压光纸；尼龙纤维、赛璐璐薄膜、粘合剂、洗涤剂、焊剂、清漆及照相显影剂等。另一种是为许多产品提供润滑性，如：金属、瓷砖、瓷品的成形润滑剂，纺丝和纺织纤维、制轮胎和医疗外科缝线的润滑剂，乳胶泡沫制成的脱膜剂等。

聚乙二醇200：可作为有机合成的介质及有较高温度要求的热载体，在日用化学工业作保湿剂和无机盐增溶剂，粘度调节剂。在纺织工业中用作柔软剂、抗静电剂、造纸与农药工业中润湿剂。

聚乙二醇400、600：用作医药，化妆品的基质，橡胶与纺织工业的润滑剂和润湿剂。600在木材工业中作保湿剂，在金属工业加于电解液中可增强研磨效果，增强金属表面的光泽。

聚乙二醇1000-1500：在医药、纺织、化妆品工业中用作基质或润滑剂、柔软剂；涂料工业中作分散剂，改进树脂的水分散性、柔韧性，用量为10-30%；油墨中可提高染料的溶解能力，降低其挥发性；在蜡纸和印台油墨中尤为适用；也可在圆珠笔油墨中作调节油墨粘稠度用；橡胶工业用作分散剂，以促进硫化作用，以及用作碳黑填充料的分散剂。

聚乙二醇2000-3000：用作金属加工铸膜剂，金属拉丝、冲压或成型的润滑剂及切削液，研磨冷却抛光剂、焊接剂，造纸工业中作润滑剂。

聚乙二醇4000-6000：在医药、化妆品工业中用作基质，起调节粘度、熔点的作用。在橡胶、金属加工工业中作润滑剂、冷却剂，在农药、颜料工业生产中作分散剂、乳化剂，纺织工业中用作抗静电剂、润滑剂。

包装及贮存：
聚乙二醇200-600用50kg塑料桶；聚乙二醇1000用10kg塑料桶；聚乙二醇1500-6000用25kg纸袋。贮存于阴凉、干燥处，注意防火，避免与热和氧化物接触。

㈢ 为什么PEG-400是增塑剂,而PEG-2000是致孔剂

聚乙二醇与许多有机物组份都具有良好的相溶性
PEG-200 无色透明 平均分子量版在190-210万左右，权 粘度为22-23
PEG-2000 白色固体 平均分子量1800-2200 粘度5.0-6.7
它们都可以用作润滑增塑，只是 PEG-200更容易分散，好混配。

㈣ 说明对于PSf+PEG+DMAc体系制备PSf膜时，三个组成分别起到什么作用

晚上好，PSf是主要成膜高聚物为单体，PEG是增塑剂和柔软剂为成膜提供必要的机械强度，DMAc是主要溶剂为溶解PSf至均匀分散的液相请酌情参考。其中一般情况下PSf是不可替换的，PEG和DMAc可以换成对成膜有利的任意溶剂比如PPG、乙二醇或者丙三醇（也可以换成邻苯二甲酸酯），和DMF、DEF或者NMP。

㈤ GOPEG化学中是什么意思

GOPEG化学中是什么意思
滤芯功能：

PP棉：对原水进行初过滤，去除水中较粗颗粒杂质、污泥、胶体版、悬浮权物质等。

颗粒活性炭：吸附水中异味、异色、有机物、部分重金属等

碳棒活性炭：进一步去除氯、有机化合物、异色、异味、浊度等。

RO反渗透膜：孔径0.1纳米，清除水中细菌、病毒、重金属、等有机杂质。

后置活性炭：调节出水的PH值、改善口感。

㈥ PEG聚乙二醇浓缩的原理

蛋白质浓缩

浓缩

生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的：

减压加温蒸发浓缩
通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。
空气流动蒸发浓缩 空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。
冰冻法 生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。
吸收法 通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。
超滤法 超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo 超滤膜的分子量截留值
膜名称
分子量截留值
孔的大的平均直径

XM －300
300，000
140

XM－200
100，000
55

XM－50
50，000
30

PM－30
30，000
22

UM－20
20，000
18

PM－10
10，000
15

UM－2
1，000
12

UM05
500
10

用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。

㈦ peg 7甘油椰油酸酯在化妆品生产中的作用与其性质

peg 7甘油椰油酸酯是一种天然油脂与环氧乙烷反应制得的亲水性润肤酯，可用于表面活专性剂体系补充属油脂，富脂添加剂，对泡沫影响小，可替代水溶性羊毛，作为油脂可溶于透明产品中，可维持皮肤和头发的油脂平衡，减少干燥感，增加皮肤和头发的润滑感，适用于各种洗澡、水剂产品。

广泛的应用于香波、浴液洗面奶、泡沫浴露用富脂剂等个人清洁用品中。

peg 7甘油椰油酸酯最大的作用就是与油脂有互溶性，且黏度低，延展性好，对皮肤渗透性好。同时具有调理机能，滋润肌肤的功效。

缺点：对眼睛具有较强的刺激性。

(7)反渗透膜制孔添加PEG扩展阅读：

贮存方法：

1、贮存于清洁干燥处，应注意密封贮存。注意防潮，防水，防热，严禁与强氧化剂混放。

2、贮运中要防潮、防热、防水。禁止与强氧化剂（如硝酸、高锰酸钾等）放在一起。按一般易燃化学品规定贮运。

甘油椰油酸酯的特点：

适用于水溶液的分析、溶剂、气量计及水压机缓震液、软化剂、抗生素发酵用营养剂、干燥剂、润滑剂、制药工业、化妆品配制、有机合成、塑化剂。可与水以任何比例溶解，低浓度丙三醇溶液可做润滑油对皮肤进行滋润。

㈧ PEG在电镀中做什么用

PEG（聚乙二醇）是电镀铜中用得比较多的一种添加剂，其阻化铜的电沉积的解释理论较专多，总的倾向于PEG分子属的氧原子因静电反应呈螺旋状卷绕在Cu+的周围，Cu+与吸附于表面的Cl-发生静电反应，在阴极表面形成阴极膜，阴极膜减慢了阴极反应速度。
表面阻化膜的稳定性与PEG的分子量有关，相对分子质量越大吸附膜越稳定，膜的阻化
作用越强。当PEG相对分子质量太小时，在电极表面得不到致密的阻化层；太大时，其对铜的电沉积抑制作用受强制对流的影响比较大。
相对分子质量在6 000~8 000的PEG与SPS、Cl-联合运用能得到较好的填充效果。
据研究，在酸性镀铜溶液中添加不同分子量的PEG对直径为50微米、深径比为1的镀层盲孔填充效果的影响.结果表明,随着PEG分子量的增加,电镀铜溶液的微孔填充力明显提高。

㈨ PEG介导的原生质体转化

此方法首先要获得去细胞壁的原生质体，可用胞壁降解酶除去芽管或菌丝的细胞壁。通常使用的是酶混合物，例如纤维素酶、蜗牛酶、溶壁酶等，这些胞壁降解酶混合使用通常会更好地发挥去壁作用，在原生质体准备过程中，要求渗透压稳定剂。1987年Penttila等第一次在里氏木霉（Trichoderma reesei）原生质体制备基础上利用PEG介导实现木霉的转化，以后的其他研究者的木霉PEG转化大多是在他的基础上进行改良而来，在原生质制备过程中成功使用山梨醇保持渗透压稳定，浓度为1.2M，MgSO₄可以作为替代品。此外，有些真菌使用甘露醇或NaCl也是可行的（Fincham et al.，1989）。T.reesei使用1.0～1.2M的山梨醇可有效控制渗透压稳定性，后代再生率为90%。经过PEG转化，原生质体再生率从90%降至12%～35%。PEG转化技术的主要优势在于尽管不同物种的原生质体形成和传代是非常多样的，但该方法均可适用。一般来说，原生质体储存越久，转化效果越差（Penttila et al.，1987b），所以原生质体需要现用现制备。此外，原生质体常常不止一个细胞核，这需要做长时间净化处理以得到同核体。

PEG介导的原生质体转化法是通过PEG的介导作用将遗传因子转入受体细胞原生质体中的一种方法，原生质体的制备与再生是转化的关键，此外CaCl₂也是不可或缺的成分。目前，多数丝状真菌的转化以原生质体作为感受态细胞，在一定浓度的CaCl₂和PEG等条件下和需转化的外源DNA混合完成的。因此，PEG介导的原生质体转化法包括原生质体的制备和原生质体转化两个主要过程。

8.1.1.1 原生质体的制备与再生

原生质体制备的最大障碍就是细胞壁，木霉菌细胞壁的主要成分为多糖，其次为蛋白质、类脂。多糖主要有几丁质、纤维素、葡聚糖、甘露聚糖等。因此，目前主要通过使用纤维素酶、蜗牛酶或溶壁酶等酶法去除细胞壁。具体采用的酶种类、浓度等需要通过具体的实验来确定。影响原生质体制备的因素很多，不同的木霉有其较为适当的形成条件。主要考虑的因素有：①菌龄的选择。菌丝的菌龄对原生质体的产量影响很大，不同菌龄的菌丝在同样的条件下酶解所得到的结果不同，利用合适菌龄的菌丝所得的原生质体明显较多，这与许多霉菌的原生质体分离的情况相似，菌龄过长，菌丝细胞壁发生老化增厚，不易于释放原生质体，菌龄过短则菌丝体易破裂，释放原生质体数量较少，因此，需要针对不同的菌株生长发育情况具体确定合适的菌龄。②破壁酶系统的选择。适当的破壁酶组合是成功地释放原生质体的关键。由于真菌的细胞壁组成复杂，使用单一酶类处理一般效果不理想，所以，通常会采用多个酶的组合配制成复合酶液，并确定相应的酶解时间和酶解温度等相关条件。③渗透压稳定剂对原生质体释放的影响。形成原生质体后，细胞膜失去细胞壁的保护，容易破损，不易保存，而渗透压稳定剂可以维持原生质体细胞膜内外压力恒定和原生质体形状，使原生质体不易破裂且有助于后续试验的进行。因此，渗透压稳定剂是影响原生质体产量的关键因素之一。常用的渗透压稳定剂有山梨醇、葡萄糖、甘露醇、蔗糖、MgCl₂、KCl、NaCl等，例如Penttila等（1987b）在制备T.reesei原生质体时使用山梨醇保持渗透压稳定，浓度为1.2M，浓度为1.2M的MgSO₄也可作为替代的材料。此外，针对某些真菌使用甘露醇或NaCl也是可行的（Fincham et al.，1989）。针对木霉的原生质体制备有选用无机盐的，例如田媛等（2010）制备康宁木霉（T.koningii）原生质体时发现无机盐溶液有利于原生质体的释放，而糖醇类不利于原生质体释放。原因可能是无机盐能够促进酶的活性，使酶与细胞能够充分接触。渗透压缓冲液中NaCl最好，KCl次之。而赵乐辉等（2005）在制备木霉T21和T22原生质体时发现蔗糖和甘露醇最合适，所以具体选用什么试剂作为制备原生质体的渗透压稳定剂还需根据具体情况来定夺。

原生质体的再生是进行转化后筛选的关键步骤，每个再生后的原生质体可以成为一个无性生殖体，影响再生的因素很多，主要有：①酶浓度和酶解时间。酶浓度对原生质体再生影响很大，由于使用的破壁酶多数为复合酶，其中会含有对原生质体有害的酶类（例如过氧化物酶、核糖核酸酶等），这些酶必然会影响原生质体的活性。过高的酶浓度使细胞破壁太彻底导致原生质体的细胞膜破裂，使再生率降低。酶解时间对原生质体产量和再生有双重影响。酶解时间短，对原生质体活性影响较小，因而有利于再生，但是原生质体的产量相对低；而延长酶解时间，虽然可以提高原生质体产量，但对原生质体活性影响较大，因而原生质体的再生率明显降低。所以，酶解时间的选定要统筹考虑原生质体的产出率和再生率。②渗透压稳定剂的影响。有些无机盐有利于原生质体的产出，但再生时可能在平板周围形成高盐环境而不利于菌落的形成，而使用糖醇类的渗透压稳定剂由于其对原生质体具有保护作用，还可作为营养利于菌丝生长，所以可能比无机盐更有效。③不同再生培养基对原生质体再生有显著影响。例如黄玉茜等（2005）发现，将制备好的木霉菌T23原生质体分别在基础培养基、完全培养基、改良查氏培养基上再生，结果表明，在基础培养基上再生率最高，平均达到25.4%，其次为完全培养基，再生率平均为21.3%，改良查氏培养基的再生效果最差。

再生率＝（高渗溶液稀释所长出的菌落数-用无菌水长出的菌落数）/加入原生质体数×100%

在液体再生培养基中可以观察到原生质体的再生方式，木霉的原生质体通常会在渗透压稳定剂的作用下，液泡吸水而膨大，在体内形成一个或多个大液泡，并向一端伸展，失去圆球形状，并形成不规则的突起，不规则的突起然后类似出芽状长出念珠状畸形萌发管，最后发育成正常菌丝。

8.1.1.2 原生质体转化

原生质体与外源DNA在包含CaC1₂的PEG缓冲液中混合，最后将原生质体涂布于再生培养基中选择转化子。其主要原理是PEG能使细胞膜之间或DNA与膜之间形成分子桥，促使细胞接触和粘连；或是通过引起表面电荷紊乱，干扰细胞间的识别，而有利于细胞间的融合或外源DNA的进入。一般认为，PEG与细胞膜内的水、蛋白质和糖类分子形成氢键，使得原生质体连在一起而发生凝聚，并由于Ca²⁺的存在而加强，这种细胞间凝聚能够促进DNA的吸收。PEG浓度过高或作用时间过长，易于使原生质脱水破裂，失去再生活性，从而使转化率下降。

为了筛选转化子，转化载体一般需要携带抗性标记基因，按基因编码产物的功能可将这些选择标记分为三大类，即营养缺陷型标记、药物抗性标记和功能产物标记：

（1）营养缺陷型标记：包括一些碳源、氮源和硫源的代谢基因，它们能与相应的营养缺陷型丝状真菌受体菌遗传互补，从而通过营养缺陷筛选出目标转化子，常见的营养缺陷筛选有编码精氨酸生物合成途径中鸟氨酸氨甲酞转移酶的argB⁺基因和编码尿嘧啶生物合成途径中的乳清苷-5’-磷酸脱羧酶的Pyr4⁺基因。

（2）药物抗性标记：目前常用的药物抗性标记有编码苯菌灵抗性的bml基因，编码寡霉素抗性的oliC基因；还有来自细菌的潮霉素抗性基因（hygB）、苯并咪唑类杀菌剂抗性基因 Ben^R、博来霉素抗性基因（Zeo^R）、G418 抗性基因（Neo^R）、抗硫胺素基因（ptrA）、腐草霉素抗性基因及氨基糖苷类，大环内酯类，金属糖肽类抗生素抗性基因等，其中，潮霉素抗性基因的应用最为广泛。

（3）功能标记：构巢曲霉（Aspergillus nilans）amds基因编码乙酞胺酶，而黑曲霉菌及许多其他的丝状真菌不能合成此酶，因此，将这些丝状真菌涂布在以乙酞胺为唯一碳源或氮源的选择性培养基上，即可方便地筛选携带amds型质粒的转化子。1995年Thrane等通过PEG介导的原生质体转化方法将来源于大肠杆菌的β-葡萄糖醛酸苷酶（GUS）基因和绿色荧光蛋白（GFP）基因转入哈茨木霉（T.harzianum）T3中，木霉菌转化子也可在x-gal平板上呈现蓝色反应或在荧光显微镜下分生孢子梗和分生孢子被观察到绿色荧光的存在，可用于木霉菌的在植物上定殖和在土壤等环境中的分析检测研究。

大多数丝状真菌的转化载体在宿主菌中不能自主复制，而是同源或者异源整合到宿主菌的基因组中。重组效率依赖于多种因素，包括转化的方法和条件、转化的宿主菌、转化的DNA片段与宿主基因组的同源程度及同源序列的长度等。营养缺陷型标记有可能引导载体质粒整合染色体的同源部位，易于筛选，但作为受体的营养缺陷型的筛选比较困难，特别是对一些工业生产菌、病原菌和多倍体菌株几乎难以实现，而药物抗性标记和功能标记则避免了前者的缺点，但带来的环境生物安全问题值得探讨。即使不存在任何选择性压力，转化子在有丝分裂过程中会表现出高度的不稳定性，抗药性筛选容易出现阳性假转化子现象。大多数的丝状真菌转化实验都证明了这一点，尤其对粗糙脉袍菌的转化实验。转化子DNA丢失不稳定的原因可能有部分重复DNA的甲基化、DNA的被切割和DNA重排等。下面提供一种本实验室常用转化木霉方法，仅供参考，具体步骤如下：

（1）原生质制备：取1mL木霉分生孢子悬浮液（1×10⁸孢子/mL）接种到PD中，28℃下振荡培养20h。用4层无菌纱布过滤收集菌丝体，无菌水冲洗5次，0.16M KCl冲洗至菌丝半透明。向菌丝中加入2mL浓度为10mg/mL的溶菌酶，混匀，30℃下放置3h后用4层纱布过滤，0.6M KCl冲洗。滤液在5000r/min下离心15min。获得的原生质体用STC［原生质体保存培养基，0.6M蔗糖、10mmTris-HCl（pH8.0）、10mmCaCl₂］冲洗两遍，悬浮于STC中在4℃下保存。

（2）原生质体再生：先在培养皿底部铺上一薄层OcmBOTTOM培养基（1mol/L蔗糖的CM培养基；OcmTOP培养基：OCM中加入1%琼脂；OcmBottom培养基：OCM中加入1.5%琼脂），再将原生质体与冷却至40～45℃的再生培养基轻轻混合，倒入上述平板，黑暗培养4～5d，计再生菌落数。原生质体再生率计算：

原生质体再生率＝再生培养基上生长的菌落数（个）∕涂布原生质体数量（个）×100%

（3）原生质体转化：将准备好的质粒5μg加入含有200μL原生质体的50mL离心管中混合均匀，室温下静置20min；加入1mL40%PTC［原生质体再生培养基，1×STC中含40%（W/V）PEG8000］，0.22μm细菌过滤器过滤除菌到管中，轻轻混匀，室温下静置20min；加入5mL TB3（含50μg/mL 氨苄青霉素），室温、175r/min下摇床培养过夜。

（4）原生质体筛选：将培养过夜的原生质体在3500r/min下离心10min，弃上清液，用剩余大约5mL的残液悬浮沉淀；融化Bottom Agar培养基并冷却到65℃，转移10mL Bottom Agar培养基到含有已复生原生质体的50mL离心管中，加入氨苄青霉素到终浓度50μg/mL，混匀后快速倒入平板；25℃培养10h后，再倒上含有较高浓度潮霉素的Top Agar筛选培养基，25℃下培养2～3d后，挑取平板上的单个菌落，转接含有无抗培养基上培养传代，并经过PCR鉴定和southern blot鉴定确定转化子。