树脂培养瓶
『壹』 树脂瓶是不是有害
成品应给在正常的状态下没有什么害的吧
『贰』 在实验的过程中,养细胞的培养瓶有哪几种规格,每种规格的培养瓶大概是多少毫升。
三角瓶25、75、150cm2;摇瓶125ml、250ml、500ml、1L、3L
『叁』 细胞培养一般用多少毫升的培养瓶,另外培养瓶的容量与培养面积各代表什么
厄……这得看你养什么 需要细胞的数量级是多少……比如25cm2 培养瓶指的是底面积 他的容量代表他一共装多少ml液体
『肆』 培养瓶盖子怎么选择
培养瓶根据材质可以分为玻璃的和塑料的,以下是关于培养瓶的选择,可以根据自己培养的细胞去选择相应的培养瓶。
细胞
培养瓶,顾名思义就是用来培养细胞的。根据材质可以分为玻璃的和塑料的,底部形状有正方形、长方形、三角形等,根据瓶子容积有5至500ml供选择。另外,表面经过特殊改性处理后,可以让细胞更好的进行贴壁培养,这样根据细胞贴壁面积又可以分为25~175cm2多种。
国产的
细胞培养瓶
一般盖子都是封闭的,不带内垫,常用于密闭培养,可保证其密闭性;进口的培养瓶的盖子样式比较多:密闭盖、聚酯盖、透气盖、隔垫盖等。密闭盖的性能和国产的是相同的,聚酯盖常用于开放培养,只需轻轻旋松瓶盖便可保证瓶内气体与环境中气体的交换。透气盖是在瓶盖中加了0.2μm疏水滤膜,提供无菌气体交换,减少污染的风险。常用于开放培养,推荐用于co2培养箱培养,尤其适用于需要长期培养的实验。隔垫盖是在隔垫上带有预切割口,这样可以使吸嘴(或者5ml以下规格的移液管)穿插隔垫进行加液、吸液或者收获细胞,减少污染的机会,维持培养瓶封闭无菌的环境。
培养瓶的瓶颈也有多种样式,有直颈、斜颈、角度颈、三角形、矩形。
直颈:可以减少培养基因晃动而流到瓶盖里;
斜颈:易于倾注,移液管或者细胞刮容易进入瓶体;
角度颈:移液管或者细胞刮易于进入瓶身,并且可减少培养基因晃动而流到瓶盖;
三角形:移液管或细胞刮更易达到瓶角,宽底增加稳定性;
矩形:斜颈的矩形培养瓶瓶底至瓶颈是一个坡度设计,易于倾注,移液管或者细胞刮容易进入瓶体,大部分斜颈瓶都有一个裙边以增加稳定性。直颈和角度颈的矩形培养瓶整个瓶底都是培养面,节省空间并减少培养基因晃动而流到瓶盖。
『伍』 塑料培养瓶与玻璃培养瓶的优缺点都是什么啊
有关塑料器皿如何消毒处理的帖子很多,先转载一法供参考:塑料制品的清洗
(1)用洗专涤剂清洗,自来属水冲洗数遍。
(2)次强酸洗液浸泡2—6 h。
(3)自来水冲洗10次以上,蒸馏水涮洗3次。
(4)浸泡在70%乙醇1 h以上,备用。
(5)临用前从70%乙醇中取出,在超净台内紫外线照射1 h左右方可使用。也可在洗净后不经70%浸泡,而用塑料袋包好,成箱地去照射6OCo灭菌。
『陆』 培养瓶的主要分类
按细胞对产品的贴壁要求分为三类:
普通型适合细胞和组织的悬浮培专养;
标准型具有良好的细胞属贴壁性能,适用于细胞的贴壁生长;
专用型表面含有含氮官能团,能促进某些特殊细胞(如肿瘤细胞)的贴壁、生长和分化。
按瓶子外形分为:
宽体培养瓶;
三角培养瓶;
斜颈培养瓶。
『柒』 哪位做过脂肪细胞原代培养
方案 23.12 脂肪细胞的原代培养
实验材料
DMEM-ADMEM-B胶原蛋白酶雄性 Sprague-Dawley 大鼠
试剂、试剂盒
KRBH缓冲液KRBH-A缓冲液
仪器、耗材
Petri培养皿锥形离心管聚丙烯管低密度聚丙烯瓶尼龙滤网尖解剖剪Perry镊塑料箱铡刀移液器
实验步骤
一、切除附睾脂肪垫
1. 在充有 70 % CO2和 30 % O2混合气体的塑料箱内麻醉大鼠(雄性 Sprague-Dawley 大鼠:145~170 g,CD 系(Charles River Breeding Laboratories)。
2. 用铡刀断头放血。
3. 将鼠体在 70 % 乙醇内浸泡一会儿。
4. 尽量在无菌条件下切除附睾脂肪垫。
(a)用一把解剖剪剖开下腹部皮肤,暴露腹膜。
(b)用另一把解剖剪剖开腹膜,然后用 Perry 镊向上牵拉睾丸。
(c)剪取附睾脂肪垫,注意保留血管。
5. 将组织移送到培养实验室。
脂肪细胞的胶原蛋白酶(在 2 ml KRBH 缓冲液加入 20 mg/ml 胶原蛋白酶,然后用 0.22 μm 滤器过滤)消化和洗涤
6. 将 4 g 脂肪垫(相当于 8 个附睾的脂肪垫)放入盛有 4 ml KRBH 缓冲液 (Krebs-Ringer 液,pH 7.4,添加 10 mmol/L NaHCO3、30 mmol/L HEPES(Sigma)、200 nmol/L 腺苷(Boche)和 1 % BSA (W / V,Intergen)。配制 1 L KRBH 缓冲液时,用 7 g NaCl、0.55 g KH2PO4、0.25 g MgSO47H2O、0.84 g NaHCO3、0.11 g CaCl2、7.15 g HEPES、10 g BSA、1 ml 200 μmol/L 腺苷, 加超净水至 1 L。然后,按 100 ml 分装。使用前加热至 37°C,并将 pH 调整至 7.4。)(37°C)的 30 ml 低密度聚丙烯瓶内。
7. 将脂肪垫剪成直径约为 2 mm 的组织块。
8. 将组织块放入瓶内,然后加入 1 ml 胶原蛋白酶液。在 37°C 水浴振荡器孵育约 1 h,直至细胞混合物形成乳脂样浓稠液体。
9. 胶原蛋白酶消化后,向瓶内加入 4 ml KRBH 缓冲液(37°C)。
10. 通过搅拌混匀瓶内的细胞,然后用孔径为 250 μm 的尼龙滤网(孔径为 250 μm,放入支持物或漏斗内)将细胞轻轻滤入 50 ml 锥形离心管。
11. 通过向离心管内加入 30 ml KRBH 缓冲液(37°C)洗细胞。用台式离心机短时间离心( 200 g),然后用吸管吸出下清液。注意脂肪细胞浮在水性缓冲液的上面。
12. 通过加入 40 ml KRBH 缓冲液洗细胞,离心,除去下清液。重复该步骤 1 次。
13. 用 40 ml DMEM-A (DMEM,pH 7.4,添加 25 mmol/L 葡萄糖、2 mmol/L 谷氨酰胺、200 nmol/L(R )-N6-(l-methyl-2-phenylethyl)腺苷(PIA,Sigma)、100 μg/ml 庆大霉素和 25 mmol/L HEPES。按 100 ml 分装,使用前加热至 37°C)(37°C)洗细胞 2 次。
14. 用约 40 % cytocrit DMEM-A 混悬漂浮的细胞。
二、脂肪细胞的原代培养
15. 用 200 μl 大口径吸头将 2 ml 40 % cytocrit DMEM-A 悬液移入 60 mm 培养皿。
16. 将培养皿放入湿润的培养箱,在 37°C 和 5 % CO2的条件下培养 1.5 h 。
17. 向培养皿内加入 5 ml DMEM-B(DMEM-A,添加 7% BSA)。
此时,应进行葡萄糖摄取实验 [ Quom 1998 ],检査细胞的活力。
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中山医科大学学报(AcadJSUMS),2001,22(6):443~446443
人前脂肪细胞的原代培养
王竹晨1,刘建中2,李??燕2,杨冬梓1,邝健全1
(中山医科大学??1.孙逸仙纪念医院妇产科,2.生物教研室,广东广州??510120)
摘??要:??目的 建立人前脂肪细胞原代培养方法,以更深入地研究人体脂肪组织增生的生物学特征。??方法 选用成人的腹部脂肪组织,采用原代消化细胞培养法培养出棱形细胞;同时取皮肤组织,进行成纤维细胞培养作为对照。??结果 培养出的棱形细胞成分均一,增殖旺盛,分化率高。经形态学动态变化的观察,生长曲线及油红O脂肪染色抽取法测定,证明是功能活跃的前脂肪细胞,并在体外重现了其增殖的全过程。??结论 在成熟的脂肪组织中存在着可分化成熟、生成脂肪的前脂肪细胞。由于脂肪细胞是胰岛素作用的经典靶细胞之一,本实验为进一步研究与肥胖及胰岛素抵抗相关的疾病如多囊卵巢综合症等打下了基础。
关键词:前脂肪细胞;细胞培养;脂肪组织
中图分类号:Q254,R711.75??????文献标识码:A??????文章编号:1000-257X(2001)06-0443-04
WANGZhu??chen1,LIUJian??zhong2,LIYan2,YANGDong??zi1,KUANGJian??quan1
(1.,SunYat??senMemorialHospital,2.DepartmentofBiology,
SunYat??,Guangzhou510120,China)
Abstract:??Objective .??Methods Usingprimarycellculture,fibroblast??..??Results Thecellswerehighlyhomogeneous,.,growthcurve,,.Undercontrolledconditions,.??Conclusion Inmaturehumanadiposetissue,.,thisstudylaidthebasisforfur??syndrome.
Keywords:preadipocyte;cellculture;adiposetissue
????脂肪细胞是胰岛素作用的经典靶细胞之一,与
肥胖及胰岛素抵抗相关疾患如多囊卵巢综合症的
研究关系密切,近年来受到妇科内分泌领域的重
视。前脂肪细胞是一类具有增殖和向脂肪细胞分
化能力的特异化的前体细胞,它的存在和作用持续
于人的一生,我们从人脂肪组织中培养出了前脂肪
细胞,为进一步研究打下了基础。
????收稿日期:2001-04-23
????基金项目:广东省卫生厅科研基金资助课题(2001189)
????,;1??材料与方法1.1??组织来源选取2000年9月~2001年1月本院妇科内分泌病房行输卵管复通术的正常体重患者。年龄20~40岁,身体健康,无其他急慢性疾病。术中开腹时切取皮下脂肪组织及皮肤组织。
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1.2??试验材料
1.2.1??主要试验用品和化学试剂??DMEM/F??12培养基(1!1),无支原体胎牛血清,?型胶原酶,Hepes,人转铁蛋白,青、链霉素原液均购自GIBCO公司;生物素、泛酸盐、氢化可的松,三碘甲状腺原胺酸(T3),3??异丁基??1??甲基黄嘌呤均系SIGMA公司产品。牛血清白蛋白购自Roche公司。试验所需无机试剂购自广州市医药公司化试批发部,均系分析纯试剂。培养瓶购自KORNING公司。
1.2.2??培养基及主要试剂的配制??培养基A[1]中山医科大学学报(AcadJSUMS),2001,22(6)培养基A制成细胞悬液,接种至25cm2培养瓶内,密度为每平方厘米3?10个细胞,置37#,体积分数5%CO2培养箱内孵育16h后,PBS轻轻洗去培养瓶内未粘附的物质,换用培养基C诱导和维持脂肪细胞分化,3d后更换为培养基B,以后每2~3d更换一次培养基B。1.3.2??人前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞的组织学染色??盖玻片剪成0??5cm?1??0cm大小,接种时置入培养瓶内,待细胞贴壁后每2、3d从培养瓶内取出染色。将贴有脂肪细胞的面朝上,浸入体积分
数为10%甲醛的等渗盐缓冲液中固定10min,然后放入PBS缓冲液中,轻轻漂洗片刻,直立使残留水份流到边缘,吸水纸吸掉。稍干燥后,人前脂肪细胞采用苏丹%??&滴染法及Mayer苏木素复染细胞核,甘油明胶封片;皮肤成纤维细胞采用常规苏木素-伊红染色,脱水透明后中性树脂封片,光镜观察并拍照保留结果。
1.3.3??细胞生长曲线的绘制??将细胞悬液等量接种至24个培养瓶内,随机分成8组,每组3瓶,每2d检测一组中每个瓶中的细胞总数,取3个瓶的均值,如此至第8组结束。细胞计数方法参照医学细胞生物学实验[3]。
1.3.4??油红O染色提取法测定细胞内的脂肪含量??接种方法同1.3.3,根据Ramirez[2]4:按说明取DMEM/F??12培养粉5g,加入胎牛血清使其体积分数为10%,三蒸水定容至500mL;培养基B:按说明取DMEM/F??12培养粉10g,加入终浓度分别为15mmol/LNaHCO3,15mmol/LHep??es,33??mol/L泛酸盐,17??mol/L人转铁蛋白,100000U/L青霉素,0??1g/L链霉素,100nmol/L氢化可的松,60nmol/L胰岛素,0??2nmol/LT3,三蒸水定容至1000mL;培养基C:取培养基A200mL,加入3??异丁基??1??甲基黄嘌呤,使其终浓度为0??25mmol/L;消化液:称取胶原酶(?型)150mg,牛血清白蛋白2g,0??01mol/L磷酸缓冲盐溶液(PBS)定容至100mL;红细胞溶解缓冲液:称取适量NH4Cl,K2HPO4和EDTA,使其终浓度分别为154mmol/L,5??7mmol/L,和0??1mmol/L,三蒸水
定容至250mL。上述溶液均经调整pH值至7??4~7??6,0??22??m微孔滤膜正压过滤除菌,分装后置-30#保存。油红O工作液[2]等的方法测定。培养物用体积分数10%甲醛的等渗盐缓冲液固定1h后,蒸馏水漂洗。吸取油红O工作液10mL,使培养面向下浸染,2h后倒掉瓶内的油红O
工作液,蒸馏水漂洗培养瓶数次,直至完全漂浮干净。将已染色的培养瓶置于32#孵箱内蒸发掉瓶内的水份后即加入1mL异丙醇,萃取出的染液即刻用吸管移出,于HITACHIG2000型分光光度计510nm波长处测吸光度。:称取4??2g油红O溶于1200mL异丙醇中室温静置过夜,分析滤纸过滤后收集滤液,并加入900mL三蒸水,于4#再次静置过夜后过滤两次即可于室温贮存备用。1.2.3??仪??器??CO2培养箱,倒置显微镜等。1.3??方??法
1.3.1??人前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞的原代培养[1]??术中切取脂肪组织约60g,同时切取皮肤组织约0??5cm?3cm进行成纤维细胞培养作为对照。PBS洗涤,分离去除脂肪组织中肉眼可见的纤维成份及血管,皮肤组织则需去除表皮和皮下脂肪,剪碎成约2mm?2mm的小块,加入消化液,置37#,体积分数5%CO2培养箱内消化。15h后,200?g短时离心,去除漂浮的脂肪细胞及培养液,沉积的细胞用红细胞溶解缓冲液再次配成细胞悬液,37#孵育10min,以去除污染的红细胞,150??2??结??果2.1??原代培养的人前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞形态学观察细胞贴壁后初为小圆形,核/浆比例较大(图1??1),4d即可观察到细胞渐成梭型,7d左右此棱形细胞大量繁殖,面积达到培养瓶底1/2之后开始积聚脂肪颗粒(图1??2)。9d可观察到细胞由棱形渐变成椭圆形或圆形(图1??3),积聚有脂肪颗粒的
第6期??王竹晨,等.人前脂肪细胞的原代培养445肪细胞(图1??4)。体外培养的脂肪细胞体积较大,细胞膜较薄,膜轮廓不光滑,凹凸不平有皱折,胞质内有大量圆形脂滴,大小不等且多散在,也有小脂滴大量触合成大脂滴的情况,核仍位于边缘,而同时培养的皮肤成纤维细胞增殖速率相似,但始终为长棱形,无脂滴积聚(图2??1,图2??2)。
2.2??人前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞的生长曲线
由生长曲线可见人前脂肪细胞(图3??1)和皮肤成纤维细胞(图3??2)的倍增时间分别为60h和55h
。3??讨??论3.1??人前脂肪细胞培养在妇科内分泌领域的研究意义脂肪细胞是脂肪组织的重要组成部份,也是其发挥功能的主体。当代研究认为脂肪组织中脂肪细胞非常活跃,细胞的数目,形态及细胞内脂肪的含量均处于动态变化之中,并保持终生。肥胖症被认为是脂肪细胞增殖和分化失控的结果。目前,肥
胖已成为与妇科内分泌领域密切相关的疾病,肥胖可产生胰岛素抵抗/高胰岛素血症,而胰岛素抵抗/高胰岛素血症是许多临床疾病或病症,尤其是常见的内分泌代谢性疾病如糖尿病、高血压和动脉粥样硬化等的共同危险信号,因此成为近年医学多学科共同感兴趣的研究热点。特别是近年的研究发现
图3.1??人前脂肪细胞生长曲线
Fig.3.1??
culture胰岛素抵抗/高胰岛素血症还与育龄妇女高雄激素血症及无排卵有关。临床常见的多囊卵巢综合症,
生育年龄妇女中约有5%~10%患者此症,常伴有肥胖,病因不明。目前认为多囊卵巢综合症即是以胰岛素抵抗为特征的内分泌代谢性疾患,继发于胰岛素抵抗的高胰岛素血症对造成高雄激素征象起着重要作用,并致不孕[4]。脂肪细胞作为对胰岛素
图3.2??人皮肤成纤维细胞生长曲线
Fig.3.2??敏感的靶细胞之一,因此对其潜在胰岛素抵抗机制的研究具有特殊临床意义。体外前脂肪细胞培养
能完整地认识脂肪组织的发生和增生的全过程,并且可以直接观察各种因素对这个过程的调控,研究其机制,是研究脂肪组织的理想模型。国外虽已建立了来源于鼠的前脂肪细胞的细胞株如3T3??L1、3T3??F442A,ob17系列等,但到目前为止,尚未见有人的前脂肪细胞株建立[5],因而使进一步的研究受到了限制。
3.2??体外培养的人前脂肪细胞的生物学特性
目前国内外前脂肪细胞体外培养系统大致有两类,一类来源于血管基质组份细胞(stromalvas??cularfraction,SVF),这是经典的前脂肪细胞。Van等[6]对SVF的系统研究形成了完整的前脂肪细胞理论。他们将切下的脂肪组织用胶原酶处理,再将组织悬液离心,其中的沉淀物基质血管成份即是SVF,将其SVF进行培养,和培养的成纤维细胞比较,这两种培养物以差不多的速率增殖,倍增时间约55h左右。在显微镜下比较细胞,发现起初2.3??前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞生长过程中细胞内脂肪含量的变化前脂肪细胞内的脂肪含量于培养9d后迅速增加,16d左右到达高峰,而皮肤成纤维细胞内仅有极少的脂肪积聚(图4)
。图4??前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞生长过程中细胞内脂肪含量的变化Fig.4??lture
446
可积聚大量脂滴,而成纤维细胞的胞浆内则无或只有少量的脂滴。这就证明了SVF是具有增殖和向脂肪细胞分化潜能的前脂肪细胞。本实验研究结果与之相符,符合文献中提出的3个标准[6]。此外,近年还有人报道采用脂肪组织块贴壁和天花板培养相结合的方法也获得了成功[7]。此种方法得到的前脂肪细胞与SVF不同,可能来源于Carraro等发现的成熟脂肪细胞内都有的一种细胞岛[8]。但此种方法是采用有血清培养并且与成熟脂肪细胞共同孵育,不适于作为成熟脂肪细胞所分泌的某些细胞因子的体外研究模型。
前脂肪细胞的培养阐明了其增殖和分化的关系,目前认为这是一种生长停顿?生长再续?细胞分化的连续关系。生长停顿是必要的第一步,此后这些细胞至少进行一次以上的再分裂,才继续向成熟脂肪细胞转化。并随时间的推移出现甘油??3??磷酸脱氢酶(GPDH)mRNA这个晚期标志物,这也是脂肪合成所必需的限速酶,并最终变成脂肪细胞。我们的研究也观察到细胞贴壁后经过一段时间的潜伏期后开始生长,3、5d左右大量增殖,1周后开始有脂肪颗粒的积聚。培养2周时,分化成多脂滴或单脂滴的脂肪细胞,与文献报道一致。
油红O染色提取法可简便、快速地对体外培养的前脂肪细胞转化率进行定量。文献报道其准确性和敏感性与测定前脂肪细胞分化过程中的标志酶GPDH相似[2]。因此常用来作为对体外培养的前脂肪细胞进行鉴定。体外培养的前脂肪细胞在胰岛素、氢化可的松等的作用下,GPDH即开始上升并迅速增加,8d左右达到高峰并维持在高水平[2]。我们采用油红O染色提取法进行研究,结果表明,前脂肪细胞在培养第3天即开始有脂肪的积聚,1周后积聚量明显增多,2周时达到高峰,与形态学上的培养1周后细胞内开始出现脂肪颗粒相吻合。并说明酶的出现在先,脂肪出现在后,细胞内脂肪含量的明显增加比GPDH的出现要晚1周左右,与文献报道相吻合[2]。
3.3??人前脂肪细胞培养技术的特点
脂肪组织来源于原始的网状结缔组织,由结缔组织和脂肪细胞组成,细胞成分中以脂肪细胞为主,此外还含有网状细胞,间充质细胞,组织细胞,内皮细胞等。脂肪细胞和成纤维细胞均来自中胚层,因此培养脂肪细胞和培养成纤维细胞具有相似[9]中山医科大学学报(AcadJSUMS),2001,22(6)外培养条件有差异[10],不同的是需要促脂肪形成因子的作用,目前已知的这类物质有:胰岛素、糖皮质激素、甲状腺素、生长激素、转铁蛋白,3??异丁基??1??甲基黄嘌呤,纤维粘连素等。培养基一般采用DMEM和F12按1!1比例配制,细胞数量适中,初次接种时细胞贴壁不十分牢固,动作要轻柔以免细胞漂浮。选用的取材对象越年轻越容易生长。人类一般选用外科手术切取腹部脂肪组织,如用注射器抽吸则易损伤细胞,降低成活率。(本文图1,2见插页2)参考文献:[1]HaunerH,PetruschkeTH,RussM,etal.(TNF??)??[J].Dibetologia,1995,38(7):764.[2]Ramirez??ZacariasJL,Castro??MunozledoF,kuri??Har??cuchW.??[J].Histochemistry,1992,97(6):493.[3]赵??刚,刘建中.医学细胞生物学实验与习题[M].北京:科学出版社,1999.35.[4]DunaifA.??drome[J].Endocrinol&MetabClinNorAm,1999,28(2):341.[5]BillingsE,MayJW.Historicalreviewandpresentsta????constructivesurgery[J].PlastReconstrSurg,1989,83(2):368.[6]VanRLR,BaylissCE,RoncariDAK.rsinculture[J].JClinInvest,1976,58(9):699.[7]朱晓海,何清濂,林子豪.人前脂肪细胞培养及增殖与分化模型的建立[J].中华整型烧伤外科杂志,1999,15(3):199.[8]CarraroR,LiZH,JohnsonJE.ntratadipocytes[J].CellTissRes,1991,264(2):243.[9]刘??清,邓漪平.内皮-平滑肌联合培养:细胞间相互作用对组织型纤溶酶原激活剂的影响[J].中山医科大学学报,1992,13(4):18.[10]朱永源,利天增,苏爱云,等.人表皮细胞的体外培养[J].中山医科大学学报,1998,19增刊:34.(??,)
『捌』 做BOD测定实验里面用到的培养瓶是哪种瓶子,有图片的最好,谢谢
溶解氧瓶
『玖』 细胞培养瓶、培养板的材料是聚苯乙烯,为什么要用聚苯乙烯做
聚苯乙烯是一种无色透明的热塑性塑料,具有高于100℃的玻璃转化温度,并且无色、透明,光学性能极好,并有高刚性。
『拾』 PC 材料的培养瓶和玻璃的培养瓶各有什么优缺点 求助
PC是塑料,重量更轻,方便挪移,磕碰不会破,耐用。玻璃的嘛,比较重,不方便移动,但是透明度好,能更好的观察里面的情况。